Un Proteoliposoma Basada Eflujo Ensayo para determinar una sola molécula Propiedades de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canales y Transportadores

Resumen

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Resumen

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Introducción

En las últimas dos décadas la capacidad para sobreexpresar y purificar las proteínas de transporte de membrana ha aumentado dramáticamente: canales iónicos, transportadores primario y secundario están ahora purificaron rutinariamente a partir de sistemas de expresión heterólogos, así como de fuentes naturales. Constantemente se están desarrollando nuevos enfoques para controlar la expresión, mejorar y facilitar la extracción y mejorar la estabilidad de estas proteínas ^1-5. Estos avances tecnológicos han sido fundamentales en el desencadenamiento de la explosión de la información estructural a nivel atómico en las proteínas de membrana que, a su vez, mejorado nuestra comprensión de las bases estructurales de su función. En contraste, nuestra capacidad para investigar las propiedades funcionales de las proteínas purificadas no aumentó en la misma proporción, de modo que en algunos casos alta resolución información estructural está acompañada por datos funcionales cualitativos, lo que limita nuestra capacidad para probar cuantitativamente predicciones basadas en la estructura. Por lo tanto, la development de ensayos funcionales cuantitativos y generalizables es un paso clave hacia la elucidación de las bases mecanicistas de la función de las proteínas de membrana.

Aquí se describe un ensayo de flujo de salida que se puede utilizar para determinar cuantitativamente propiedades funcionales clave de purificado y reconstituido Cl ^- canales y transportadores. Los principios subyacentes del ensayo se pueden generalizar a una variedad de sistemas de transporte, así como a las proteínas no-iónicos transporte. Los liposomas se reconstituyen con purificados Cl ^- canal / transportadores en la presencia de un gran Cl ^- gradiente (Figura 1A, B). Cl ^- flujo de salida se inicia mediante la adición de un ionóforo para permitir flujo de contra-ión, en nuestro caso el K ⁺ valinomicina ionóforo, que la tensión de derivación establecido por el Cl ^- y establecer el gradiente de potencial inicial membrana para el potencial de equilibrio de K ^{+ 6,7.} Sin tque ionóforo no significativa Cl neta ^- flujo de salida se produce, ya que se evita mediante la generación de un potencial transmembrana. Los datos se describe cuantitativamente por dos parámetros medibles (Figura 1C): τ, la constante de tiempo de eflujo de Cl ^-, y f _0, la fracción de liposomas que no contienen una proteína activa. De τ f ₀ y el unitaria Cl ^- velocidad de transporte, la fracción de proteínas activas y la masa molecular del complejo activo se pueden derivar ^8. La técnica se ilustra aquí usando proteoliposomas reconstituidos con CLC-EC1, un bien caracterizado de tipo CLC H ⁺ / Cl ^- intercambiador de la estructura y función conocida. Este ensayo se generaliza fácilmente a los canales o transportadores con diferente selectividad iónica o cuya actividad depende de la presencia de voltaje y / o ligandos. Además, este ensayo se puede usar para determinar si las moléculas pequeñas afectan directamente a la proteína reconstituida,para cuantificar los efectos de estos compuestos y cómo composición de la membrana o de los reactivos modificadores de lípidos afectan a la función de los canales y transportadores reconstituidas.

Protocolo

1. Preparación de lípidos

1. Alícuota de los lípidos cantidad deseados en un tubo de vidrio transparente. Tu Ves. coli extracto lipídico polar, pero la mayoría de composiciones lipídicas pueden ser utilizados. Si los lípidos están en forma de polvo, ellos resuspender en cloroformo a una concentración de 20 mg / ml. Secar los lípidos a TA bajo _N2 gas hasta que todo el disolvente se haya evaporado.
2. Resuspender los lípidos en pentano y secar de nuevo un flujo constante de gas N ₂ para eliminar los restos sobrantes de cloroformo. Seco hasta que todo el disolvente se haya evaporado. Si bien el secado, gire suavemente el tubo de manera que el lípido se distribuye en una película uniforme que cubre el tercio inferior del tubo en lugar de una formación de una masa densa en la parte inferior.
3. Añadir el tampón de reconstitución que contiene detergente (300 mM KCl, 50 mM de ácido cítrico, 25 mM de K ₂ HPO _4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) para disolver los lípidos. Utilice otros detergentes suaves para este paso si la proteína es poco tolerante a la CHAPS.
4. Resuspend los lípidos a la claridad utilizando un aparato de ultrasonidos baño de agua. Sumergir el tubo en el centro del baño de agua sonicador la máxima potencia a corto (30 seg-1 min) con impulsos cortos (30 seg-1 min) pausas. La solución debería quedar claro.
   NOTA: El grado final de la claridad lograrse depende de la composición lipídica específico usado. Alguna variación de lote a lote en este paso, incluso entre los lípidos nominalmente idénticos, también es posible. Bruma residual es debido a la dispersión de la luz por las grandes partículas en la suspensión, que se pueden eliminar por centrifugación.
5. Incubar los lípidos se resuspendieron a temperatura ambiente durante 20-60 min.

2. Proteoliposoma Formación

NOTA: Varias estrategias se puede emplear para insertar la proteína solubilizada con detergente en liposomas. Para CLC-EC1 diálisis funciona bien y por lo tanto es el método de elección ^6,9,10.

1. Añadir la proteína purificada a la deseada proteína-lípido (P / L) relación (expresada en microgramos o f proteína / mg de lípidos). La selección de la relación P / L depende de la finalidad del experimento.
   1. Si el objetivo es evaluar la actividad de la proteína de interés, reconstituir a alta P / L's para maximizar la señal, ya que cada liposoma contiene múltiples copias de la proteína. Para cuantificar la actividad y / o la velocidad de transporte unitario de la proteína, reconstituir en un régimen de dilución de Poisson a baja P / L's, de modo que cada vesícula contiene en promedio proteína 1. Vea el paso 7 y Discusión para un análisis más profundo de cuándo utilizar cada régimen.
2. Para determinar los valores de P / L óptimas para los diferentes regímenes, realizar una valoración completa de la actividad como una función de la concentración de proteína ^8,11-13. Sin embargo, para cualquier proteína para la que el peso molecular (MW, expresado en kDa) de la unidad activa se conocen los siguientes valores P / L se pueden utilizar como guesstimates iniciales:
   pg "/>
   
3. Cargue la proteína y mezcla de lípidos en un tubo de diálisis pre-humedecida o un casete. Coloque el dispositivo de diálisis en un vaso de precipitados que contiene 500-1,000x el volumen del tampón de reconstitución de lípidos (es decir, 1 L de tampón de 1 ml de la resuspensión de lípidos) bajo agitación suave.
   1. Cambio búfer 3-4 veces a intervalos de> 3 horas. En cada cambio de solución, lavar la casete / tubo y el vaso de precipitados con agua destilada y llenar el vaso de precipitados con tampón de reconstitución fresco. Incluya 2.1 O / N intervalos para el cambio de solución. El número exacto y la duración de los cambios solución depende de la exacta de lípidos y detergentes utilizados.
4. Después de la última etapa, retire los liposomas de la vasija de diálisis, alícuota en tubos y flash les congele en N2 _líquido o congelación a -80 ° C.

3. Registro de Configuración

NOTA: La grabación de configuración (Figura 2A) se compone de dos cámaras (cilindros de fondo plano, ~ volumen 3-4 ml), un Cl ^- (ver más abajo) de electrodo, un medidor de pH con un análogo o salida digital eléctrica, un digitalizador, y un ordenador con un software de adquisición correspondiente.

1. Conectar el Cl ^- electrodo al medidor de pH, la salida del medidor de pH para el digitalizador que está conectado a la computadora. Coloque el electrodo de referencia en una cámara y el cable de recodificación en la otra (Figura 2B).
   NOTA: La polaridad de los cables es correcta si? V _Cal (ver Paso 6.4 y 7.2) es positiva.
2. Coloque las cámaras en una placa de agitación con una barra de agitación en la cámara de grabación (Figura 1B). Asegúrese de que la barra de agitación no toque el electrodo.
3. Conectar las cámaras utilizando un puente de agar (Figura 2B) (100 mM KCl y 2% de agarosa). Guarde los puentes de agar en 100 mM KCl.

4. Preparación de la Cl ^- Electrodo

1. Tome un electrodo de edad y -eventualmente- que no funciona pH. Romper el recubrimiento de vidrio para revelar completamente los cables de plata.
2. Retire cuidadosamente el recubrimiento de los cables de plata usando una hoja de bisturí. Limpie los cables usando copiosas cantidades de H ₂ O y EtOH.
3. Colocar en una solución saturada de FeCl ₃ (o lejía) hasta que los cables están cubiertos con una capa oscura uniforme de AgCl.

5. Preparación de vesículas unilamelares

1. La noche antes de los experimentos, se hinchan 1 g de Sephadex G-50 bolas en 15 ml de tampón externo (1 mM KCl, 150 mM de K ₂ SO _4, ácido cítrico 25 mM, pH 4,5) con agitación suave (no revuelva) para al menos 3 horas a RT antes de su uso. Cada experimento requiere ~ 3 ml de perlas hinchadas. Mantenga las perlas hinchadas a 4 ° C durante unos días como máximo.
2. Mientras que los liposomas están descongelando a temperatura ambiente, se vierte en cada columna ~ 3 ml de hinchadas G-50 perlas. Deje que se sequen por gravedad a RT; esto por lo general toma 1-2 min.
3. Preparar vesículas unilamelares por extrusión de los proteoliposomas 11 veces a través de un Mini-Extrusora utilizando un punto de corte 0,4 m de teflón.
4. Colocar la columna en un tubo de fondo redondo de plástico. Haga girar las columnas para eliminar el exceso de solución. Centrifugar durante 20-30 segundos a 1400 xg en una centrífuga clínica.
5. Desechar el flujo a través, la columna de lugar en un tubo de vidrio de 13 x 100 mm y añadir 100 l de las vesículas extruidos a la columna. Girar la columna durante 1 min a 500 xg en una centrífuga clínica.
6. Recoger ~ 200 l de flujo a través que se añadirán a la cámara de grabación en el paso 6.5.

6. Eflujo Medición

1. Coloque 2 ml de KCl 100 mM en la cámara (tierra) de referencia y 1,8 ml del tampón externo (1 mM KCl, 150 mM K ₂ SO _4, ácido cítrico 25 mM, pH 4,5) a la cámara de grabación. El desequilibrio leve osmótico entre el interiory soluciones externas no afecta
2. Inicie el programa de adquisición. Deje que la línea de base se equilibre, esto puede tardar unos minutos.
3. Una vez que la señal llega a una línea de base estable (los liposomas están listos y las columnas seco), iniciar la grabación (Figura 3A).
4. Añadir 15 l de una solución 10 mM KCl para calibrar el sistema (Figura 2A).
5. Añadir liposomas. Un pequeño salto podría ser visible debido a la eliminación incompleta de Cl externa ^- a partir de los proteoliposomas (Figura 3A). Espere hasta que se estabilice la línea de base.
6. Añadir valinomicina (1 l de 1 mg / ml en EtOH) para iniciar el eflujo (Figura 3A).
7. Deje que el flujo de salida siga su curso temporal hasta que mesetas (Figura 3A).
8. Añadir 40 l de 1,5 M β-octilglucósido (β-OG) preparado en el tampón externo para disolver todos los liposomas (figura 3A). Termine la grabación.

7. Datos Análisis

1. Exportar el archivo de rastreo de en un formato ASCII o texto e importarlo al programa de análisis de la elección.
2. Mida la tensión en los siguientes puntos (Figura 3A):
   Al comienzo de la grabación (V _0);
   Después de la adición del pulso de calibración (V _cal);
   Después de la adición de los liposomas (V _lipo);
   Al final de el flujo de salida (V _fin);
   Después de la adición de detergente (V _tot);
   Los voltajes de línea de base de manera que V ₀ = 0.
3. Use la ecuación de Nernst-Plank para determinar el valor experimental de midiendo
   
   Cuando Vol _Cal es el volumen del impulso de calibración en l, 1,800 es el volumen de cámara en el comienzo del experimento se expresa en1; l, [Cl] _{cal / en} son el Cl ^- concentraciones del impulso de calibración y de la memoria intermedia externa en mM y _cal? V es el salto en mV medido después del pulso de calibración.
   NOTA: Esta determinación empírica de α sirve para tres propósitos: asegura que el sistema responde correctamente, ofrece una medida de la consistencia de la respuesta del instrumento entre los experimentos, así como para comprobar que no se han cometido errores en la fabricación solución.
4. Calcular las concentraciones de Cl después de cada paso de la siguiente manera:
   
   
   
   El factor de 3/400 proviene de la dilución del impulso de calibración 15 l en el volumen final de 2.000 l.
5. Calculcomieron los cambios en [Cl] en cada paso, ΔCl _{lipo / def / tot.}
6. Convertir V (t) en Cl (t) con
   
   Determinar directamente los valores [CL] en los puntos críticos y compararlos con los valores calculados como un control interno.
7. Normalizar la traza para que la ^lipo Cl _rel = 0 y Cl ^tot _rel = 1
   
8. Montar el supuesto tiempo de flujo a la siguiente ecuación:
   
   Donde L es la tasa de Cl ^- fuga que se determina experimentalmente mediante la medición de Cl ^- flujo de salida a partir de liposomas libres de proteínas preparados en las mismas condiciones y τ es la constante de tiempo del proceso.
9. Calcular v, la velocidad inicial:
   
   Cuando ΔCl _aleta se expresa en milimolar y V es el volumen de la cámara en l.
10. Calcular la tasa de transporte / conductancia
    
    Donde p es el P / L, MW es el peso molecular del complejo activo expresada en kDa

Resultados

Se describe un protocolo detallado y robusto para medir Cl ^- transporte mediado por purificada CLC-ec1, un procariota tipo CLC H ⁺ / Cl ^- intercambiador, reconstituido en liposomas. Una representación esquemática del experimento se muestra en la Figura 3 proteoliposomas reconstituidos con purificada CLC-ec1 y contiene alta Cl interna ^-. Se sumergen en un baño de solución que contiene bajo Cl ^-. Bajo estas condiciones netas Cl ^- flujo ...

Discusión

Hemos descrito un protocolo detallado para medir la Cl ^- transporte mediado por canales o transportadores reconstituidas en liposomas aniones selectiva purificados. El ejemplo utilizado fue el procariota H ⁺ / Cl ^- Intercambiador CLC-ec1. Sin embargo, la metodología se puede adaptar fácilmente para estudiar canales cerrados por ligandos ^{12,13,15, 11,12} tensión, o deportivo selectividad diferente aniónico ^15,16 sustituyendo el Ag: electrodo AgCl con uno adecuado ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer