A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

Resumo

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Resumo

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^- from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Introdução

Nas últimas duas décadas, a capacidade para sobre-expressar e purificar proteínas transportadoras de membrana aumentou dramaticamente: canais de iões, os transportadores principal e secundário são rotineiramente purificado a partir de sistemas de expressão heterólogos, bem como as fontes naturais. Novas abordagens para monitorar expressão, melhorar e facilitar a extração e melhoram a estabilidade dessas proteínas estão sendo constantemente desenvolvidos ^1-5. Estes avanços tecnológicos têm sido fundamentais para desencadear a explosão de informações estruturais em nível atômico em proteínas de membrana, que, por sua vez, reforçada a nossa compreensão das bases estruturais da sua função. Em contraste, a nossa capacidade para sondar as propriedades funcionais das proteínas purificadas não aumentaram com a mesma velocidade, de modo que, em alguns casos, a informação estrutural de alta resolução é acompanhada pelos dados funcionais qualitativos, limitando assim a capacidade de testar quantitativamente previsões baseadas em estrutura. Assim, o desenvot de ensaios funcionais quantitativos e generalizáveis ​​é um passo fundamental para a elucidação das bases mecanicistas da função da proteína de membrana.

Descrevemos aqui um ensaio de efluxo que pode ser utilizado para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da purificados e reconstituídos Cl ^- canais e transportadores. Os princípios subjacentes a ensaio pode ser generalizada para uma variedade de sistemas de transporte, bem como para o transporte de proteínas não-iônicos. Os lipossomas são reconstituídos com purificados Cl ^- / canal transportadores, na presença de um grande gradiente de Cl ^- (Figura 1A, B). Cl ^- efluxo é iniciada pela adição de um ionóforo para permitir fluxo de contra-ião, no nosso caso, o K ⁺ ionóforo valinomicina, que desviam a tensão estabelecida pela Cl ^- gradiente e definir o potencial de membrana inicial do potencial de equilíbrio de K ^{+ 6,7.} Sem tele não ionóforo Cl líquido significativo ^- efluxo ocorre, uma vez que é impedida pela geração de um potencial transmembranar. Os dados são descritos quantitativamente por dois parâmetros mensuráveis ​​(Figura 1C): τ, a constante de tempo de efluxo de Cl ^-, e f _0, a fracção de lipossomas que não contêm uma proteína activa. De τ ₀ e f o Cl unitário ^- a taxa de transporte, a fracção de proteínas activas e a massa molecular do complexo activo pode ser derivado ^8. A técnica é ilustrada aqui, usando proteoliposomes reconstituídos com CLC-EC1, um bem caracterizado CLC-tipo H ⁺ / Cl ^- trocador de estrutura e função conhecida. Este ensaio é prontamente generalizado para canais ou transportadores com diferentes selectividade iónica ou cuja actividade depende da presença de tensão e / ou ligantes. Além disso, este ensaio pode ser usado para determinar se as moléculas pequenas afectar directamente a proteína reconstituída,para quantificar os efeitos destes compostos e composição como membrana ou reagentes modificadores de lípidos afectar a função dos canais reconstituídos e transportadores.

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Protocolo

1. Preparação Lipid

1. Alíquota os lípidos quantidade desejada para um tubo de vidro transparente. Use E. coli extracto de lípidos polares, mas a maioria das composições de lipidos podem ser usados. Se os lípidos são na forma de pó, ressuspender em clorofórmio a uma concentração de 20 mg / ml. Secar os lípidos à temperatura ambiente sob atmosfera de N _{2 gasoso} até todo o solvente se ter evaporado.
2. Ressuspender os lipídios em pentano e secá-lo novamente um fluxo constante de gás N ₂ para remoção de vestígios que sobraram de clorofórmio. Seco até todo o solvente tenha evaporado. Enquanto a secagem, rodar suavemente o tubo de modo a que o lípido é distribuído numa película uniforme que cobre o terço inferior do tubo em vez de uma formação de uma massa densa na parte inferior.
3. Adicionar o tampão de reconstituição contendo detergente (KCl 300 mM, ácido cítrico 50 mM, 25 mM de K ₂ HPO _4, pH 4,5, CHAPS a 35 mM) para dissolver os lípidos. Usar outros detergentes suaves para este passo, se a proteína é mal tolerante para CHAPS.
4. Resuspend os lipídios a clareza usando um banho de água sonicator. Mergulhar o tubo no centro do banho de ultra-sons de água à potência máxima de curta duração (30 sec-1 min) com pulsos de curta duração (30 sec-1 min) faz uma pausa. A solução deve ficar clara.
   NOTA: O grau final de clareza obtida depende da composição do lípido específico utilizado. Alguma variação lote-a-lote neste passo, mesmo entre lípidos nominalmente idênticas, também é possível. Turvação residual é devido à dispersão da luz pelas partículas grandes em suspensão, que podem ser removidos por centrifugação.
5. Incubar os lípidos ressuspensas a TA durante 20-60 min.

2. proteolipossoma Formação

NOTA: Várias estratégias podem ser empregues para inserir o detergente-proteína solubilizada em lipossomas. Para CLC-EC1 diálise funciona bem e é, por conseguinte, o método de escolha ^6,9,10.

1. Adicionar a proteína purificada para a desejada proteína e lípido (P / L) razão (expressa em ug o f proteína / mg de lípido). A escolha da relação P / L depende do objectivo da experiência.
   1. Se o objectivo é o de avaliar a actividade da proteína de interesse, em reconstituir alta P / L para maximizar o sinal, uma vez que cada liposoma contém múltiplas cópias da proteína. Para quantificar a actividade e / ou a taxa de transporte unitário da proteína, reconstitua num regime de diluição de Poisson em baixo P / L, de modo que cada vesícula contém, em média, uma proteína. Veja o Passo 7 e Discussão para uma análise mais profunda de quando usar cada regime.
2. Para determinar os valores de P / L óptimas para os vários esquemas, realizar uma titulação completa da actividade como uma função da concentração de proteína ^8,11-13. No entanto, para qualquer proteína para a qual o peso molecular (PM, expressa em kDa) da unidade activa é conhecido os seguintes valores de P / L podem ser utilizados como guesstimates iniciais:
   pg "/>
   
3. Coloque a mistura de proteína e lípido num tubo de diálise pré-humedecido ou uma cassete. Colocar o dispositivo de diálise num copo contendo 500-1,000x o volume do tampão de reconstituição lípido (isto é, um tampão de L para 1 ml de ressuspensão lipídica) sob agitação suave.
   1. Mudança de tampão de 3-4 vezes em intervalos de> 3 h. Em cada mudança solução, lava-se a cassete / tubo e o copo com água destilada e enche o recipiente com tampão fresco a reconstituição. Incluir 1-2 S / N intervalos para a mudança solução. O número exacto e duração da solução muda depende do lípido exacta e detergentes utilizados.
4. Após a última etapa é concluída, remova os lipossomas a partir do navio de diálise, aliquotar-los em tubos e flash congelá-los em N ₂ líquido ou congelar a -80 ° C.

3. A gravação Set-up

NOTA: A gravação de set-up (Figura 2A) consiste de duas câmaras (cilindros de fundo plano, ~ 3-4 ml de volume), um Cl ^- (veja abaixo) eletrodo, um medidor de pH com um análogo ou saída digital elétrica, um digitalizador e um computador com um software de aquisição apropriado.

1. Ligue o Cl ^- eléctrodo para o medidor de pH, a saída do medidor de pH para o digitalizador que está ligado ao computador. Inserir o eléctrodo de referência em uma câmara e o fio recodificação no outro (Figura 2B).
   NOTA: A polaridade dos fios é correto se AV _Cal (ver Passo 6.4 e 7.2) é positivo.
2. Coloque as câmaras numa placa de agitação com uma barra de agitação na câmara de gravação (Figura 1B). Certifique-se a barra de agitação não toca o eletrodo.
3. Ligar as câmaras que utilizam uma ponte de agar (Figura 2B) (KCl 100 mM e 2% de agarose). Guarde as pontes Agar em KCl 100 mM.

4. Preparação do Cl ^- Eléctrodo

1. Tome um eletrodo de pH não-funcionamento de idade e -possibly-. Quebrar o revestimento de vidro para revelar completamente os fios de prata.
2. Retire cuidadosamente o revestimento dos fios de prata, usando uma lâmina de bisturi. Limpe os fios usando grandes quantidades de H ₂ O e EtOH.
3. Lugar numa solução saturada de FeCl ₃ (ou cloro) até fios são cobertos com um revestimento escuro uniforme de AgCl.

5. Preparação de Unilamelares Vesicles

1. A noite antes das experiências, inchar 1 g de Sephadex G-50 em grânulos de 15 ml de tampão externo (1 mM KCl, 150 mM de K ₂ SO _4, ácido cítrico 25 mM, pH 4,5) com agitação suave (não agite) para pelo menos 3 horas à temperatura ambiente antes da sua utilização. Cada experiência requer ~ 3 ml de pérolas inchadas. Manter os grânulos inchados a 4 ° C durante alguns dias no máximo.
2. Embora os lipossomas são descongelar à temperatura ambiente, verter em cada coluna de ~ 3 ml de inchados G-50 grânulos. Deixe-os secar por fluxo de gravidade na RT; isso geralmente leva 1-2 min.
3. Preparar vesículas unilamelares por extrusão dos proteolipossomas 11 vezes através de um mini-extrusora utilizando um ponto de corte de 0,4 m de Teflon.
4. Inserir a coluna em um tubo de plástico de fundo redondo. Gire as colunas para remover o excesso de solução. Centrifugar durante 20-30 segundos a 1400 x g numa centrífuga clínica.
5. Descartar escoamento, lugar coluna num tubo de vidro de 13 x 100 mm e adicionar 100 ul de vesículas extrudidas para a coluna. Rotação coluna durante 1 min a 500 xg numa centrifugadora clínica.
6. Recolhe ~ 200 ul de fluxo de passagem que vão ser adicionados à câmara de registo no passo 6.5.

6. Efluxo Medição

1. Coloque 2 ml de KCl 100 mM na câmara (terra) de referência, e 1,8 ml de tampão externo (1 mM KCl, 150 mM de K ₂ SO _4, 25 mM de ácido cítrico, pH 4,5) para a câmara de registo. O ligeiro desequilíbrio osmótico entre o internoe soluções externas não afeta
2. Inicie o programa de aquisição. Deixe a linha de base equilibrar, isso pode levar alguns minutos.
3. Uma vez que o sinal atinge uma linha de base estável (os lipossomas são preparados e as colunas de secar), iniciar a gravação (Figura 3A).
4. Adicionar 15 ul de uma solução 10 mM de KCl para calibrar o sistema (Figura 2A).
5. Adicionar lipossomas. Um pequeno salto pode ser visível devido à remoção incompleta de Cl externo ^- a partir das proteoliposomes (Figura 3A). Espere até a linha de base se estabilize.
6. Adicionar valinomicina (1 ml a 1 mg / ml em EtOH) para iniciar o efluxo (Figura 3A).
7. Deixe o efluxo de correr o seu curso de tempo, até que se planaltos (Figura 3A).
8. Adicionar 40 ul de 1,5 M β-octilglucósido (β-OG), preparado no tampão externo para dissolver todos os liposomas (Figura 3A). Fim da gravação.

7. Data Análise

1. Exportar o arquivo de rastreamento a partir de um formato ASCII ou texto e importá-lo para o programa de análise de escolha.
2. Meça a tensão nos seguintes pontos (Figura 3A):
   No início da gravação (V _0);
   Após a adição do impulso de calibração (V _cal);
   Após a adição dos lipossomas (V _lipo);
   No final do efluxo (V _fin);
   Após a adição de detergente (V _tot);
   Linha de base, de modo que as tensões V ₀ = 0.
3. Utilizar a equação de Nernst-prancha para determinar o valor experimental de medindo
   
   Onde Vol _Cal é o volume do impulso de calibração em ul, 1,800 é o volume da câmara no início da experiência, expresso em1; l, [Cl] _{cal / in} são o Cl ^- concentrações do pulso de calibração e do buffer externo em mM e AV _cal é o salto em mV medido após o pulso de calibração.
   NOTA: Esta determinação empírica de α serve a três propósitos: ele garante que o sistema está respondendo corretamente, oferece uma medida da consistência da resposta do instrumento entre os experimentos, bem como para verificar se não há erros foram cometidos na tomada de solução.
4. Calcular a concentração de Cl após cada passo da seguinte forma:
   
   
   
   O factor de 3/400 vem da diluição do impulso de calibração 15 ul no volume final de 2.000 mL.
5. Calculcomeu as mudanças na [Cl] em cada etapa, ΔCl _{lipo / fin / tot.}
6. Converter V (t) em Cl (t) com
   
   Diretamente determinar os valores [CL] nos pontos críticos e compará-los com os valores calculados como um controlo interno.
7. Normalizar o traçado de modo que a ^lipo Cl _rel = 0 e Cl ^tot _rel = 1
   
8. Montar o curso de tempo de efluxo com a seguinte equação:
   
   Onde L é a taxa de Cl ^- vazamento que é determinada experimentalmente medindo Cl ^- efluxo de lipossomas livres de proteínas preparadas nas mesmas condições e τ é a constante de tempo do processo.
9. Calcular v, a velocidade inicial:
   
   Onde ΔCl _barbatana é expressa em milimolar e V é o volume da câmara em ul.
10. Calcular a taxa de transporte / condutância
    
    Em que p é a relação P / L, MW é o peso molecular do complexo activo, expresso em kDa

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Resultados

Nós descrevemos um protocolo detalhado e robusto para medir Cl ^- transporte mediado por purificada CLC-EC1, um procariota CLC-tipo H ⁺ / Cl ^- trocador, reconstituída em lipossomas. Uma representação esquemática da experiência é mostrado na Figura 3 proteoliposomes reconstituídos com CLC-purificada contendo EC1 e alta ^- Cl interno. São imersos numa solução de banho que contém baixo Cl ^-. Sob estas condições Cl líquido ^- eflu...

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Discussão

Nós descrevemos um protocolo detalhado para medir Cl ^- transporte mediado pelos canais de ânion seletivo purificadas ou transportadores reconstituídos em lipossomas. O exemplo utilizado foi o procariotas H ⁺ / Cl ^- Trocador CLC-EC1. No entanto, a metodologia pode ser facilmente adaptada para estudar canais fechados por ligandos ^{12,13,15, 11,12} tensão, ou que ostentam diferente selectividade aniónico ^15,16 substituindo o Ag: AgCl com um adequado para o ião sob ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer