إنتاج نوروفيروس الإبراز المجالات الإنسان في<em&gt; E. القولونية</em&gt; لأشعة البلورات

Summary

هنا، نحن تصف طريقة للتعبير عن وتنقية نوروفيروس جودة عالية جاحظ (P) في المجالات E. القولونية لاستخدامها في دراسات البلورات بالأشعة السينية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة إلى مجالات الفيروسة الكأسية P الأخرى، وكذلك البروتينات غير الهيكلية، أي، البروتين المرتبط بالفيروس الجينوم (VPG)، الأنزيم البروتيني، والحمض النووي الريبي RNA يعتمد البلمرة (RdRp).

Abstract

يتكون القفيصة نوروفيروس من البروتين الهيكلي رئيسي واحد، ووصف VP1. وينقسم VP1 إلى (S) نطاق قذيفة وجاحظ (P) المجال. يشكل المجال S سقالة متجاورة حول RNA الفيروسي، في حين أن الأشكال نطاق P المسامير الفيروسية في المجال S ويحتوي على المحددات لاستضداد والمضيف خلية التفاعلات. المجال P يربط الهياكل الكربوهيدرات، أي، المستضدات مجموعة HISTO الدم، والتي يعتقد أنها ستكون مهمة للعدوى نوروفيروس. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لانتاج نوعية عالية المجالات نوروفيروس P في عوائد عالية. ويمكن بعد هذه البروتينات يمكن استخدامها لالبلورات بالأشعة السينية وELISA لدراسة استضداد والمضيف خلية التفاعلات.

واستنساخ المجال P أولا إلى ناقلات التعبير وثم أعرب في البكتيريا. يتم تنقيته البروتين باستخدام ثلاث خطوات التي تنطوي يجمد معدن أيون تقارب اللوني واللوني حجم الإقصاء. فيمبدأ، فمن الممكن استنساخ، صريحة، تنقية، وبلورة البروتينات في أقل من أربعة أسابيع، الأمر الذي يجعل هذا البروتوكول نظام سريع لتحليل سلالات فيروس النورو الناشئة حديثا.

Introduction

noroviruses الإنسان هي السبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد في جميع أنحاء العالم ^1. هذه الفيروسات تنتمي إلى عائلة فيروسات كأسية، التي يوجد على الأقل خمسة أجناس، بما في ذلك نوروفيروس، Sapovirus، Lagovirus، Vesivirus، وNebovirus. وعلى الرغم من التأثير الكبير على نظام الرعاية الصحية وتوزيع واسعة، ويعوق دراسة noroviruses الإنسان من عدم وجود نظام خلية ثقافة قوية. حتى الآن، لا توجد لقاحات المعتمدة أو الاستراتيجيات المضادة للفيروسات المتاحة.

ونوروفيروس البروتين قفيصة كبير، ووصف VP1، يمكن تقسيمها إلى (S) نطاق قذيفة وجاحظ (P) للنطاق ^2. يتم توصيل المجال P إلى المجال S من منطقة المفصلي مرن (H). يشكل المجال S سقالة حول RNA الفيروسي، في حين يشكل المجال P الجزء الأبعد من قفيصة الفيروسية. يجمع المجال P إلى dimers ذات الصلة بيولوجيا عندما أعرب في البكتيريا. ف دIMER يتفاعل مع الهياكل الكربوهيدرات، يسمى المستضدات مجموعة HISTO الدم (HBGAs) التي تكون موجودة كمستضدات القابلة للذوبان في اللعاب وجدت في بعض الخلايا المضيفة ^3. ويعتقد أن P التفاعل المجال HBGA إلى أن تكون مهمة للإصابة ^4. في الواقع، وكشف تقرير صدر مؤخرا على أهمية HBGAs تركيبية أو HBGA، معربا عن البكتيريا لعدوى فيروس النورو البشري في المختبر ^5.

يتم تنفيذ الدراسات الحالية بشأن مرفق الخلية المضيفة من noroviruses أساسا مع جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) التي يمكن التعبير عنها في خلايا الحشرات أو مع مجالات P المؤتلف وأعرب في القولونية (إي كولاي). لفهم P التفاعلات المجال HBGA في قرار الذري والهياكل P المجال HBGA معقدة لا يمكن حلها باستخدام البلورات بالأشعة السينية. هنا، نحن تصف بروتوكول للتعبير عن نطاق P وتنقية الذي يسمح إنتاج نطاق P في كمية وجودة عالية لاستخدامها في البلورات بالأشعة السينيةography. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة لغيرها من المجالات الفيروسة الكأسية P والبروتينات غير الهيكلية.

وكودون الأمثل المجال P لE. التعبير القولونية والمستنسخة في ناقلات نقل القياسية. ثم يتم إعادة المستنسخة المجال P إلى ناقلات التعبير الذي يشفر polyhistidine (صاحب) العلامة وبروتين ملزمة المانوز (ب ب) التي يتم اتباعها من قبل موقع البروتيني انشقاق. يتم التعبير عن م ب ب-صاحب ف انصهار بروتين المجال في E. القولونية، تليها ثلاث خطوات تنقية. يتم تنقيته وم ب ب-صاحب ف انصهار بروتين المجال باستخدام يجمد اللوني المعادن أيون تقارب (ايماك). بعد ذلك، هو المشقوق البروتين الانصهار مع فيروسات الانف الإنسان (الهريفي) البروتيني -3C ويتم فصل المجال ف من ب ب-صاحب كتبها خطوة إضافية لتنقية ايماك. وأخيرا، يتم تنقيته المجال P باستخدام الكروماتوغرافيا حجم الاستبعاد (SEC). ويمكن بعد ذلك المجال P تنقيته أن تستخدم لالبلورات بالأشعة السينية. فحص الظروف البروتين بلورة هو PERFOrmed مع مجموعات الفرز المتاحة تجاريا باستخدام تركيزات مختلفة من البروتين نطاق P. لوحظ نمو البلورات ويتم تحسين الظروف الواعدة.

مع الأساليب المذكورة هنا، فمن الممكن أن يذهب من الجين إلى البروتين لهيكل خلال أقل من أربعة أسابيع. لذلك، أسلوبنا في التعبير ف مجال تنقية وبلورة مناسبة لدراسة التفاعل نوروفيروس المضيفة على المستوى الجزيئي، وتوفير البيانات الهامة للمساعدة في ما يصل إلى تاريخ لقاح تصميم والمخدرات الفرز.

Protocol

1. P الاستنساخ المجال

1. تحديد المنطقة نطاق P الترميز بواسطة تسلسل المحاذاة من سلالات فيروس النورو (على سبيل المثال، GII.10 سلالة، بنك الجينات: AF504671، فوسفات معرف: 3ONU) ^6. وعلاوة على ذلك، إزالة المنطقة مرنة في نهاية C-الطرفية المجال P (الشكل 2A). كودون-تحسين الحمض النووي لE. التعبير القولونية وتشمل BamHI (N-النهائي) ونوتي (C-المحطة) تقييد مواقع من أجل استنساخ الفرعي المجال P الترميز المنطقة في التعبير ناقلات pMalc2x ^6،7.
   ملاحظة: تم تحسين المنطقة نطاق P الترميز وتوليفها من قبل الخدمة التجارية. المجال P الترميز المنطقة (إدراج) ما يقرب من 1 كيلو بايت في طول وتسليمها في ناقلات نقل القياسية.
2. هضم 2 ميكروغرام من ناقلات نقل مع كل BamHI ميكرولتر 1 (20،000 U / مل) ونوتي (10،000 U / مل) تقييد الانزيمات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الشركة المصنعة تزويد المخازن.
3. فصل إدراج هضمها على هلام الاغاروز 1٪لمدة 20 دقيقة في 135 V وتنقية الحمض النووي إدراج من الجل باستخدام طقم التجارية.
4. إعداد ناقلات التعبير pMalc2x من قبل هضم 2 ميكروغرام من هذه النواقل مع كل ميكرولتر 1 BamHI (20،000 U / مل) ونوتي (10،000 U / مل) تقييد الانزيمات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تنقية ناقلات من هلام الاغاروز كما هو موضح أعلاه (1.3). ملاحظة: كل العينات (1.2 و 1.4) يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
5. Ligate إدراج تنقيته في ناقلات pMalc2x هضمها في مواقع تقييد BamHI ونوتي مع 1 ميكرولتر يغاز T4-DNA (400،000 يو / مل) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) (الشكل 2B و2C). استخدام لا يقل عن 20 نانوغرام من ناقلات pMalc2x وناقلات: نسبة إدراج 1: 3 (الوزن الجزيئي). مزيج ربط عادة ~ 20 ميكرولتر.
6. تحويل 2 ميكرولتر من مزيج ربط إلى E. 50 ميكرولتر المختصة كيميائيا القولونية DH5α الخلايا البكتيرية باستخدام بروتوكول التحول القياسي (10 دقيقة على الجليد والحرارة صدمة و 45 ثانية في 42 درجة مئوية) وتنمو في 600المتوسطة SOC ميكرولتر لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا تحولت لمدة 3 دقائق في 1000 x ج، تجاهل طاف، و resuspend بيليه في 30 ميكرولتر من المتوسطة SOC.
   1. لوحة مزيج تحول على لوحات LB أجار، تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين للاختيار، وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. اختر لا يقل عن خمس مستعمرات.
7. لكل من المستعمرات الخمس، تطعيم 2-3 ثقافة مل من LB المتوسطة تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين (LB-أمبير) وتنمو عن طريق هز بين عشية وضحاها في 160 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
8. استخراج البلازميدات من الثقافة بين عشية وضحاها باستخدام طقم التجارية. التحقق من وجود إدراج نطاق P بواسطة التسلسل مع التمهيدي إلى الأمام pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') وعكس التمهيدي (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

التعبير 2. ف المجال

1. تحويل 1 ميكرولتر (150 نانوغرام / ميكرولتر - 400 نانوغرام / ميكرولتر) من الترميز ناقلات pMalc2x ل-صاحب ف م ب ب نطاق البروتين الانصهار في 50 ميكرولتر من E. المختصة خلايا القولونية BL21 باستخدام بروتوكول التحول القياسي (10 دقيقة على الجليد والحرارة صدمة و 45 ثانية في 42 درجة مئوية) وتنمو في 600 ميكرولتر شركة نفط الجنوب متوسطة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثقافة فرعية في 120 مل من LB-أمبير بين عشية وضحاها في 160 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
2. تطعيم تسعة لترات (على سبيل المثال، 6 × 5 قوارير لتر مع 1.5 لتر المتوسطة لكل منهما) من LB-أمبير مع ثقافة فرعية (1: 100). تنمو الخلايا تهتز في 160 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى OD ₆₀₀ يصل 0،4-0،6. وفي وقت لاحق، وانخفاض درجة الحرارة إلى 22 درجة مئوية لمدة ~ 1 ساعة ثم حمل تعبير البروتين مع 0.66 ملم من الإيزوبروبيل-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ^8. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 22 درجة مئوية (~ 18 ساعة).
   ملاحظة: درجة الحرارة يمكن أن تختلف، ولكن من المستحسن استخدام 22 درجة مئوية أو أقل.
3. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (10543 x ج، 15 دقيقة، 4 درجات مئوية). تجاهل طاف وتجميد بيليه خلية في -20 درجة مئوية.

الصورة = "jove_title"> 3. 1 ^ش الخطوة تنقية والبروتياز الشق

1. إعداد المخازن المؤقتة التي يتم استخدامها أثناء الخطوات تنقية البروتين من الحلول الأسهم لضمان استنساخ والاستقرار في التجارب. إعداد أربعة مخازن مختلفة على المعدن يجمد أيون تقارب اللوني (ايماك)، كل منها يحتوي على تراكيز مختلفة من ايميدازول (10 ملم، 20 ملم، 50 ملم، و 250 ملم). المجلس الأعلى للتعليم، وإعداد عازلة هلام الترشيح (GFB) مع تركيز الملح أعلى، ولكن دون ايميدازول. استخدام الماء منزوع الأيونات وتصفية جميع المخازن قبل استخدامه مع حجم المسام 0.45 ميكرون.
   ملاحظة: للحصول على مخطط تفصيلي إعداد العازلة، الرجوع إلى الجدول 1.
2. ذوبان الجليد بيليه خلية من الثقافة تسعة لتر وتذوب في 150 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. يصوتن تعليق الخلية ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة (قوة 130 واط، السعة 20٪، تردد النبض 50٪) لتعطيل الخلايا. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد خلال صوتنة.
3. Centrifuجنرال الكتريك تعليق الخلية sonicated (43667 x ج، 30 دقيقة، 4 درجات مئوية) لفصل الحطام خلية من طاف تحتوي على البروتين التعبير عنها. جمع طاف وتجاهل بيليه.
4. غسل وتتوازن 10 مل (= 1 حجم العمود [السيرة الذاتية]) الطين من النيكل (ني) الخرز agarose -NTA مع 10 ملي العازلة ايميدازول في عمود اللوني. إضافة حبات ني معايرتها لطاف من الخطوة 3.3 تحتوي على أعرب م ب ب-صاحب ف مجال انصهار بروتين واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع دوران بطيء.
5. بعد الحضانة، وتطبيق كامل خليط ني حبة البروتين إلى عمود اللوني. غسل العمود ببطء مع كل 5 السير الذاتية لل10 مم، 20 مم، و 50 مخازن ايميدازول ملي، بدءا من 10 ملم، ثم 20 ملم وآخر 50 ملم (الشكل 3A).
6. أزل م ب ب-صاحب ف انصهار بروتين المجال باستخدام 250 ملي العازلة ايميدازول (الشكل 3A). أثناء شطف، والتحقق من _280nm OD للتحقق من شطف من البروتين الانصهار (ارتفاع OD ₂₈0nm). تواصل شطف حتى يسقط إلى ~ 0.1 في _280nm OD. تغسل حبات مع كميات مفرطة من 250 عازلة ايميدازول ملي (لا يقل عن 10 السيرة الذاتية)، تليها لا يقل عن 10 السير الذاتية من 10 ملي العازلة ايميدازول. حفظ الخرز للخطوة تنقية الثانية (القسم 4).
7. تحقق من وجود م ب ب-صاحب ف مجال انصهار بروتين مع SDS-PAGE باستخدام هلام 12٪، SDS بولكرلميد (10 × 8 سم) ⁹ (الشكل 3A). أداء هلام الكهربائي في 45 ألف و 200 V لمدة 45 دقيقة.
8. التركيز (على سبيل المثال، باستخدام مكثف التجاري) ومزال مجال م ب ب-صاحب ف البروتين الانصهار إلى تركيز النهائي من ~ 3 ملغ / مل. يلتصق الانصهار مجال م ب ب-صاحب-P مع البروتيني الهريفي-3C أثناء الغسيل الكلوي ضد 2 لتر من 10 ملي العازلة ايميدازول (~ 1: 100) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الشكل 3A). اعتمادا على الحجم النهائي من البروتين المركزة، وإجراء غسيل الكلى في كاسيت لغسيل الكلى أو أنابيب غسيل الكلى.
   ملاحظة: مقدار الهريفي-3C البروتيني للبروتينيتم احتساب انشقاق وفقا للنشاط الأنزيم البروتيني محددة (يو 2 / ميكرولتر، 1 يو كافية ليلتصق 100 ميكروغرام من البروتين)، وكمية البروتين الانصهار مزال أن يختلف على مستوى التعبير ويمكن تقدير من نتيجة SDS-PAGE (3.7 ).

4. 2 ^{الثانية} تنقية الخطوة

1. يوازن ني حبات من الخطوة 3.6 في 10 عازلة ايميدازول ملم.
2. احتضان البروتين مدال من الخطوة 3.7 (التي تحتوي على نطاق المشقوق P، البروتين م ب ب، والهريفي البروتيني) مع معايرتها ني الخرز (4.1) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع دوران بطيء.
3. ضعي الخليط ني حبة إلى عمود وجمع التدفق من خلال (المشقوق نطاق P) (الشكل 3B). قياس تركيز البروتين لانها تأتي من العمود حتى يصل إلى _280nm OD ~ 0.1.
   ملاحظة: م ب ب-صاحب يجب أن تظل ملزمة للني الخرز (الشكل 3B).
4. تحقق من وجود نطاق المشقوق P باستخدام SDS-PAGE مع 1هلام 2٪ كما هو موضح أعلاه (الشكل 3B). التركيز المجال P مزال إلى ~ 3 ملغ / مل وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ضد GFB لتنقية المجلس الأعلى للتعليم لاحقة.

5. 3 ^{الثالثة} تنقية الخطوة

1. غسل مضخات وأنابيب من نظام تنقية HPLC وقبل تتوازن المجلس الأعلى للتعليم العمود (انظر قائمة المواد) مع GFB.
2. حقن المجال P إلى العمود بمعدل تدفق من 1 مل / دقيقة باستخدام superloop (تصل إلى 12 مل) أو حلقة (ما يصل إلى 3 مل)، وهذا يتوقف على حجم العينة المركزة. بعد الانتهاء من الحقن، وزيادة معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة.
3. كما يزيد OD والمجال P تأتي من العمود، وجمع أجزاء من 1.5 مل. تحقق الكسور باستخدام SDS-PAGE مع هلام 12٪ (الشكل 4A و 4B). تجمع فقط أنقى كسور والتركيز على ~ 3 ملغ / مل و~ 8 ملغ / مل.
   ملاحظة: بعد ~ 110 مل (حجم باطل) ومزال معظم الشوائب من عمود المجلس الأعلى للتعليم مع حجم 320 مل السرير. الوعادة ما يتم مزال نطاق P باعتبارها ديمر. شطف الوقت / حجم ديمر نطاق P يعتمد على الصف الإعدادية (ص) من العمود المجلس الأعلى للتعليم.

6. بلورة المجال P

1. استخدام المجال P في ~ 3 ملغ / مل و 8 ملغ / مل لفحص بلورة الأولي. إعداد لا يقل عن 100 ميكرولتر من نطاق ف في تركيز لشاشات أولية مع 384 شروط الفرز متوفرة تجاريا. أداء الفحص عند 18 درجة مئوية في شكل لوحة 96-جيدا، حيث يحتوي على خزان 100 ميكرولتر من محلول الأم وتتكون قطرة من 0.2 حل أم ميكرولتر و 0.2 ميكرولتر من البروتين.
2. كرر وتحسين ظروف تبلور ناجحة. لذلك، استخدام لوحات 15-جيدا أن يحتوي على 3 صفوف. إعداد الصف الأول مع الحل الأم بنسبة 100٪، الصف الثاني مع 90٪ محلول الأم والماء 10٪، والصف الثالث مع 80٪ محلول الأم والمياه بنسبة 20٪. استخدام حجم قطرة من 2 ميكرولتر (1 ميكرولتر بروتين + 1 ميكرولتر أم الحل) و 50081؛ ل من الحل أم كوحدة تخزين الخزان.
3. استخدام الظروف الكريستال الأمثل للمشاركة في بلورة المجال P مع بروابط. إعداد لوحات كما هو موضح في 6.2. بدلا من 2 حجم قطرة ميكرولتر، وإنشاء قطرات تحتوي على 1 حل ميكرولتر الأم، 1 البروتين ميكرولتر، و 1 ميكرولتر من يجند بتركيز 1 ملغ / مل.
4. جمع مجموعات البيانات من هذه البلورات باستخدام أشعة السنكروترون. أداء استبدال الجزيئي باستخدام هياكل نطاق P نشرت مع تسلسل عالية تشابه كما الأولية ^6،10-13 نموذج البحث.
   ملاحظة: وجود ليجند يظهر على النحو سائل-على غرار الامم المتحدة من كثافة الإلكترونات.

النتائج

ويصور التخطيطي من البروتوكول هو موضح في الشكل 1. بروتوكول يغطي 6 أجزاء رئيسية تشمل استنساخ الجين الهدف والتعبير وتنقية من ثلاث خطوات، وتبلور الشكل 2 يوضح تصميم بناء التعبير (EC) و خصائص ناقلات التعبير pMalc2x. تسلسل موقع استنساخ متعددة (M...

Discussion

هنا، نحن تصف بروتوكول للتعبير وتنقيتها من المجالات P نوروفيروس في ذات جودة عالية وكمية. Noroviruses لم يتم دراستها جيدا، وهناك حاجة إلى بيانات الهيكلية بشكل مستمر. على حد علمنا، فإن P إنتاج المجال باستخدام بروتوكولات أخرى (على سبيل المثال، الموسومة GST المجالات P) إشكال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products