הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em&gt; E. coli</em&gt; עבור רנטגן קריסטלוגרפיה

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה להביע ולטהר norovirus באיכות גבוהה בולטות (P) תחומים ב E. coli לשימוש במחקרים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים, כמו גם חלבונים הלא מבניים, כלומר., הגנום צמוד חלבונים נגיפיים (VPG), פרוטאז, ו RNA רפליקאז (RdRp).

Abstract

קפסיד norovirus מורכב חלבון מבני גדול יחיד, כינת VP1. VP1 מחולק פגז (S) תחום תחום בולט (P). תחום S מהווה פיגום רציף סביב רנ"א הנגיפי, ואילו צורות המושלמות P קוצים ויראלי על תחום S ומכיל הקבע עבור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים. תחום P נקשר מבני פחמימות, כלומר., אנטיגנים קבוצת histo-דם, אשר נחשבים חשובים עבור זיהומי norovirus. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצור תחומי P norovirus באיכות גבוהה בתשואות גבוהות. חלבונים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו ELISA כדי לחקור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים.

תחום P הוא משובט ראשית לתוך וקטור ביטוי ולאחר מכן הביע בחיידקים. החלבון הוא מטוהר באמצעות שלושה צעדים כרוכים משותקים כרומטוגרפיה זיקת מתכת-יון כרומטוגרפיה הדרת גודל. בעקרונית, אפשר לשכפל, מפורש, לטהר, ולגבש חלבונים בתוך פחות מארבעה שבועות, מה שהופך בפרוטוקול זה מערכת מהירה לניתוח זני norovirus המתהווה.

Introduction

Noroviruses אדם הם הגורם העיקרי של גסטרואנטריטיס חריפה ברחבי העולם ^1. וירוסים אלה שייכים למשפחת Caliciviridae, אשר יש לפחות חמישה סוגים, כולל norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, ו Nebovirus. למרות השפעה הגבוה על מערכת הבריאות והפצה רחבה, חקר noroviruses אדם נפגע על ידי עדר מערכת תרבית תאים חזקה. נכון להיום, אין חיסונים שאושרו או אסטרטגיות אנטי זמינות.

חלבון קפסיד הגדול norovirus, כינת VP1, ניתן לחלק תחום פגז (S) ואת התחום בולט (P) ^2. תחום P מחובר תחום S ידי ציר גמיש (H) באזור. תחום S מהווה פיגום סביב רנ"א הנגיפי, ואילו תחום P מהווה את החלק קצוני של קפסיד ויראלי. תחום P מרכיב לתוך הדימרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית כאשר הביעו בחיידקים. ה- P דimer אינטראקציה עם מבני פחמימות, כינת אנטיגנים קבוצת histo-דם (HBGAs) שנמצאים כמו אנטיגנים מסיסים המצויים ברוק ומצאו בתא פונדקאי מסוים ^3. האינטראקציה תחום-HBGA P נחשב חשוב זיהום ^4. ואכן, לאחרונה דווח חשף את החשיבות של HBGAs הסינטטי או HBGA להביע חיידקי זיהום norovirus אנושי במבחנה ^5.

מחקרים שוטפים לגבי מצורף התא המארח של noroviruses מבוצעים בעיקר עם חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) שיכול לבוא לידי ביטוי בתאי חרקים או עם תחומי P רקומביננטי לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli). כדי להבין את יחסי הגומלין P תחום-HBGA ברזולוציה אטומית, P מבנים מורכבים תחום-HBGA ניתן לפתור באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מושלם P וטיהור המאפשר ייצור של תחום P בכמות ובאיכות גבוהה לשמש crystall רנטגןography. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים וחלבונים הלא מבניים.

תחום P הוא קודון אופטימיזציה עבור E. ביטוי coli ו משובטים לתוך וקטור העברה סטנדרטי. תחום P הוא מחדש משובט לתוך וקטור ביטוי מקודד polyhistidine התג (שלו) לבין חלבון מחייב מנוז (MBP) כי הם ואחריו אתר מחשוף פרוטאז. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מתבטא E. coli, ואחריו שלושה שלבים לטיהור. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת (IMAC). לאחר מכן, חלבון ההיתוך הוא בקע עם rhinovirus אדם (HRV) פרוטאז -3C ואת תחום P מופרד MBP-שלו על ידי צעד טיהור נוסף IMAC. לבסוף, תחום P הוא מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC). התחום P מטוהרים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. הקרנת התגבשות תנאי חלבון היא performed עם ערכות הקרנה זמינות מסחרי באמצעות ריכוזי חלבון שונים P מושלם. צמיחת קריסטל הוא ציין והתנאים המבטיחים ביותר ממוטבים.

עם השיטות שתוארו כאן, אפשר לעבור גן לחלבון לבנות בתוך פחות מארבעה שבועות. לכן, השיטה שלנו הביטוי המושלם P, טיהור, ההתגבשות מתאימה לחקור את אינטראקצית norovirus לארח ברמה המולקולרית ולספק נתונים חשובים כדי לסייע עַדכָּנִי חיסון הקרנת עיצוב תרופה.

Protocol

1. שיבוט דומיין P

1. קבע את תחום P באזור קידוד על ידי יישור רצף של זנים norovirus (למשל, זן GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) ^6. יתר על כן, הסר את האזור הגמיש בסוף C- המסוף של תחום P (איור 2 א). קודון-לייעל את ה- DNA עבור E. ביטוי coli וכוללים BamHI (N-terminal) ו NotI (C-terminal) אתרי הגבלה כדי-שיבוט תת התחום P קידוד באזור לתוך וקטור ביטוי pMalc2x ^6,7.
   הערה: תחום P באזור קידוד ממוטבת, מסונתז על ידי שירות מסחרי. תחום P קידוד באזור (להוסיף) הוא כ 1 kb באורך נמסר וקטור העברה סטנדרטי.
2. תקציר 2 מיקרוגרם של וקטור העברת עם 1 כל BamHI μl (20,000 יח '/ מ"ל) ו NotI (10,000 יח' / מ"ל) הגבלה אנזימים עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם היצרן סיפק מאגרים.
3. הפרד את הכנס מתעכל על ג'ל agarose 1%במשך 20 דקות ב 135 V ולטהר את ה- DNA הכנס מן הג'ל באמצעות ערכה מסחרית.
4. הכן את וקטור ביטוי pMalc2x ידי לעכל 2 מיקרוגרם של וקטור זה עם כל 1 μl BamHI (20,000 יח '/ מ"ל) ו NotI (10,000 יח' / מ"ל) הגבלה אנזימים עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר את הווקטור מן ג'ל agarose כמתואר לעיל (1.3). הערה: שניהם דגימות (1.2 ו -1.4) ניתן לאחסן ב -20 ° C.
5. ולקשור את הכנס מטוהרים לתוך וקטור pMalc2x מתעכל על אתרי הגבלה BamHI ו NotI עם 1 μl האנזים T4-דנ"א (400,000 U / ml) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 2B ו 2C). השתמש לפחות 20 ננוגרם של וקטור pMalc2x ו וקטור: יחס הכנס 1: 3 (משקל מולקולרי). תמהיל הקשירה הוא בדרך כלל ~ 20 μl.
6. Transform 2 μl של תמהיל הקשירה לתוך 50 μl כימי מוסמכות E. coli DH5α תאים חיידקיים באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי (10 דקות על קרח, הלם חום 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס) ולגדול 600בינוני SOC μl עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התאים שינו במשך 3 דקות XG ב 1000, לבטל את supernatant, ו resuspend גלולה ב 30 μl של המדיום SOC.
   1. פלייט לערבב טרנספורמציה על צלחות LB-אגר, המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​לבחירה, לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס. חמש מושבות בחר לפחות.
7. עבור כל אחד מחמשת מושבות, לחסן תרבות 2-3 מ"ל של LB-בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין (LB-אמפר) ולגדול ידי ניעור לילה ב 160 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
8. חלץ פלסמידים מתרבים הלילה באמצעות ערכה מסחרית. בדוק את הנוכחות של הכנס מושלם P על ידי רצף עם פריימר קדימה pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') לאחור תחל (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

2. ביטוי דומיין P

1. Transform 1 μl (150 ng / μl - 400 ng / μl) של קידוד וקטור pMalc2x עבור התחום MBP-שלו-P חלבון היתוך לתוך 50 μl של א המוסמכת coli BL21 תאים באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי (10 דקות על קרח, הלם חום 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס) ולגדול 600 μl בינוני SOC עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. תת לתוך 120 מ"ל של אמפר LB לילה ב 160 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס.
2. לחסן תשעה ליטרים (למשל, 6 x 5 צלוחיות L עם 1.5 בינוני L כל אחד) של מגבר LB עם תת (1: 100). לגדל את התאים רועד ב 160 סל"ד ו -37 ° C עד OD ₆₀₀ מגיע 0.4 - 0.6. בהמשך לכך, מנמיכים את הטמפרטורה ל 22 מעלות צלזיוס במשך ~ 1 hr ולאחר מכן להשרות את ביטוי חלבון עם 0.66 מ"מ של איזופרופיל- β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ^8. לגדל את התאים לילה בשעה 22 ° C (~ 18 שעות).
   הערה: הטמפרטורה יכולה להיות מגוונת, אבל אנחנו ממליצים להשתמש 22 ° C או נמוך יותר.
3. קציר התאים על ידי צנטריפוגה (10,543 XG, 15 דק ', 4 ° C). בטל supernatant ולהקפיא התא גלולה ב -20 ° C.

s = "jove_title"> 3. שלב טיהור ^-1 ו פרוטאז מחשוף

1. כן מאגרים המשמשים במהלך שלבי טיהור חלבונים מפתרונות מניות להבטיח שחזור יציבות של הניסויים. הכן ארבעה מאגרים שונים עבור כרומטוגרפיה זיקה יון המתכת משותקת (IMAC), שכל אחת מהן מכילה ריכוז שונה של imidazole (10 מ"מ, 20 מ"מ, 50 מ"מ, ו -250 מ"מ). עבור SEC, להכין חיץ ג'ל-סינון (GFB) עם ריכוז מלח גבוה, אך ללא imidazole. השתמש במי deionized ולסנן את כל המאגרים לפני שימוש עם גודל נקבובי של 0.45 מיקרומטר.
   הערה: ערכת הכנה חיץ מפורט, עיין בטבלה 1.
2. להפשיר את התא גלולה מתשע התרבות ליטר ו להתמוסס 150 מ"ל PBS ב 4 ° C. Sonicate השעית התא שלוש פעמים במשך 2 דקות (כוח 130 W, 20% משרעת, תדירות דופקת 50%) כדי לשבש את התאים. שמור על השעיית התא על קרח במהלך sonication.
3. Centrifuge השעית תא sonicated (43,667 XG, 30 דק ', 4 ° C) כדי להפריד פסולת תא מן supernatant המכיל חלבון לידי ביטוי. איסוף supernatant וזורקים את הכדור.
4. לשטוף לאזן 10 מ"ל (= 1 נפח הטור [CV]) תרחיף של ניקל (Ni) חרוזים agarose -NTA עם חיץ imidazole 10 מ"מ בטור כרומטוגרפיה. מוסיפים את החרוזים Ni equilibrated כדי supernatant משלב 3.3 המכיל הביעו MBP--P שלו חלבון היתוך מושלם דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C עם סיבוב איטי.
5. לאחר דגירה, להחיל את התערובת Ni-חרוז-חלבון שלם טור כרומטוגרפיה. לשטוף את העמודה לאט עם כל 5 קורות חיים של 10 מ"מ, 20 מ"מ, ו -50 מאגרים imidazole מ"מ, החל עם 10 מ"מ, אז 20 מ"מ ו 50 מ"מ (איור 3 א).
6. Elute החלבון היתוך מושלם MBP-שלו-P באמצעות חיץ imidazole 250 מ"מ (איור 3 א). במהלך elution, לבדוק את _280nm OD לאמת את elution של חלבון ההיתוך (עליית OD ₂₈0nm). המשך elution עד _280nm OD יורד ל ~ 0.1. שטפו את החרוזים עם כמויות עודפות של חיץ imidazole 250 מ"מ (לפחות 10 קו"ח), ואחריו 10 קו"ח לפחות 10 מ"מ חיץ imidazole. שמור את החרוזים על צעד הטיהור השני (סעיף 4).
7. לוודא את נוכחותו של החלבון היתוך מושלם MBP-שלו-P עם SDS-PAGE באמצעות ג'ל 12% SDS-polyacrylamide (10 x 8 ס"מ) ⁹ (איור 3 א). בצע ג'ל אלקטרופורזה ב 45 ו -200 V עבור 45 דקות.
8. תתרכז (למשל, באמצעות concentrator מסחרי) החלבון היתוך מושלם eluted MBP-שלו-P לריכוז סופי של ~ 3 מ"ג / מ"ל. קליב היתוך מושלם MBP-שלו-P עם פרוטאז HRV-3C במהלך דיאליזה נגד 2 L של 10 מ"מ חיץ imidazole (~ 1: 100) לילה ב 4 ° C (איור 3 א). בהתאם לנפח סופי של חלבון מרוכז, לבצע דיאליזה בבית צינורות קלטת או דיאליזה דיאליזה.
   הערה: כמות פרוטאז HRV-3C לחלבוןמחשוף מחושב בהתאם לפעילות פרוטאז הספציפי (2 U / μl, 1 U מספיקה כדי לדבוק 100 מיקרוגרם של חלבון) וכמות חלבון היתוך eluted משתנה על רמת הביטוי וניתן לאמוד מתוך תוצאת SDS-PAGE (3.7 ).

שלב טיהור 4. 2 ^nd

1. לאזן את-חרוזים ניקל משלב 3.6 ב 10 חיץ imidazole מ"מ.
2. דגירת חלבון dialyzed משלב 3.7 (המכיל תחום P בקע, חלבון MBP, ו-פרוטאז HRV) עם סיבוב Ni-החרוזים (4.1) equilibrated למשך 30 דקות ב 4 ° C עם איטי.
3. החל את התערובת Ni-חרוז לעמודה ולאסוף את הזרימה דרך (תחום P ביקע) (איור 3 ב). למדוד את הריכוז של חלבון כפי שהיא באה את הטור עד _280nm OD מגיע ~ 0.1.
   הערה: MBP-שלו צריך להישאר כבול אל-חרוזי ניקל (איור 3 ב).
4. בדוק את הנוכחות של תחום P בקע באמצעות SDS-PAGE עם 1ג'ל 2% כפי שתואר לעיל (איור 3 ב). לרכז את תחום P eluted כדי ~ 3 מ"ג / מ"ל ​​ו dialyze לילה ב 4 ° C נגד GFB לטיהור SEC שלאחר מכן.

שלב טיהור 5. 3 ^rd

1. לשטוף משאבות וצינורות של מערכת טיהור HPLC מראש לאזן את העמודה SEC (ראה רשימת חומרים) עם GFB.
2. להזריק את תחום P לעמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל / min באמצעות superloop (עד 12 מ"ל) או לולאה (עד 3 מ"ל), בהתאם לכמות של המדגם מרוכז. לאחר הזריקה נגמר, להגדיל את קצב הזרימה 2.5 מ"ל / דקה.
3. ככל שעולה OD ואת תחום P יורד בטור, לאסוף שברים של 1.5 מ"ל. בדוק שברים באמצעות SDS-PAGE עם ג'ל 12% (איור 4 א ו -4). בריכה רק שברים הטהור להתרכז כדי ~ 3 מ"ג / מ"ל ​​ו ~ 8 מ"ג / מ"ל.
   הערה: לאחר ~ 110 מ"ל (נפח חלל) ביותר זיהומים הם eluted מעמודה SEC עם 320 מ"ל נפח המיטה. התחום P בד"כ eluted כמו דימר. Elution זמן / נפח של דימר המושלם P תלוי כיתת prep (PG) של טור SEC.

6. התגבשות של דומיין P

1. השתמש מושלם P ב ~ 3 מ"ג / מ"ל ​​ו -8 מ"ג / מ"ל ​​להקרנה התגבשות ראשונית. הכן לפחות 100 μl של תחום P לכל ריכוז למסכים ראשוני עם 384 תנאי הקרנה זמינים מסחרי. בצע סינון על 18 מעלות צלזיוס במתכונת צלחת 96-היטב, שם המאגר מכיל 100 μl של פתרון אמא וירידה מורכבת 0.2 פתרון אמא μl 0.2 חלבון μl.
2. חזור לייעל התגבשות תנאים מוצלחים. לכן, להשתמש בצלחות 15-היטב המכילות 3 שורות. הגדרה בשורה הראשונה עם פתרון אמא 100%, בשורה השנייה עם פתרון אמא 90% ו -10% מים, והשורה השלישית עם פתרון אמא 80% ומי 20%. השתמש גודל טיפה של 2 μl (1 μl חלבון + 1 μl פתרון אמא) ו -50081; l של פתרון אמא ככרך המאגר.
3. השתמש תנאים קריסטל אופטימיזציה עבור שיתוף בגיבושו של תחום P עם הליגנדים. כן צלחות כמתוארים 6.2. במקום 2 גודל טיפה μl, להגדיר טיפות המכילות 1 פתרון אמא μl, 1 חלבון μl, ו 1 μl של ליגנד בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.
4. אסוף ערכות נתונים של גבישים יחידים באמצעות קרינת synchrotron. בצע החלפה מולקולרית באמצעות מבנים מושלמים P שפורסמו עם דמיון רצף גבוה ככל ^6,10-13 מודל חיפוש ראשוני.
   הערה: הנוכחות של ליגנד מופיעה בתור בועה-דגם un של צפיפות אלקטרונים.

תוצאות

סכמטית של הפרוטוקול המתואר מתוארת באיור 1. הפרוטוקול מכסה 6 חלקים עיקריים הכוללים שיבוט של גן המטרה, ביטוי, טיהור בן שלושה שלבים, וגיבוש. איור 2 מדגימה את העיצוב של מבנה הביטוי (EC) ו מאפיינים של וקטור ביטוי pMalc2x. הרצף של אתר השיבוט המרו...

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור הביטוי וטיהור תחומי P norovirus באיכות גבוהה ובכמות. Noroviruses אינם נלמדים היטב נתונים מבניים נדרשים ברציפות. למיטב ידיעתנו, ייצור מושלם P תוך שימוש בפרוטוקולים אחרים (למשל, תחומים P-tagged GST) כבר בעייתי, עד כה, ונתונים מבניים מספיק על האינטראקצי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products