인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

요약

여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).

초록

노로 바이러스의 캡시드는 하나의 주요 구조 단백질로 구성되어, VP1 불린다. VP1은 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P) 영역으로 나누어진다. 의 S 도메인은 P 도메인 형태의 S 도메인에 바이러스 성 스파이크 반면, 바이러스 성 RNA 주위에 연속 골격을 형성하고 항원 및 호스트 세포의 상호 작용에 대한 결정을 포함한다. 는 P 영역, 즉., 생각된다 히스 - 혈액형 항원이, 노로 바이러스 감염에 대한 중요한 것으로, 탄수화물 구조를 결합한다. 이러한 프로토콜에서는, 고 수율 고품질 노로 바이러스의 P 영역의 제조 방법을 설명한다. 이러한 단백질은 항원 후 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해 X 선 결정학 및 ELISA에 사용될 수있다.

P 개의 도메인 우선 발현 벡터에 클로닝 한 다음 박테리아에서 발현된다. 단백질은 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 고정화 것을 포함 세 단계를 사용하여 정제한다. 에서원칙적으로, 명시 클론 정제,이 프로토콜 신흥 노로 바이러스 균주 분석을위한 신속하게 시스템 개 미만 주 단백질을 결정화 할 수있다.

서문

인간의 noroviruses는 급성 위장염 전 세계적으로 ^하나의 주요 원인이다. 이 바이러스는 노로 바이러스, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus 및 Nebovirus 포함 적어도 다섯 장군이가있는의 Caliciviridae 제품군에 속한다. 의료 시스템과 다양한 유통에 높은 영향에도 불구하고, 인간의 noroviruses의 연구는 강력한 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해된다. 현재까지 사용 가능한 승인 된 백신이나 항 바이러스 전략이 없다.

노로 바이러스의 주요 캡시드 단백질, VP1이 되나, 쉘 (S) 영역 및 돌출부 ^(P)이 영역들로 분할 될 수있다. P 개의 도메인이가요 성 힌지 (H) 영역으로 S 도메인에 접속된다. P 개의 영역은 바이러스 캡시드의 최 외측 부분을 형성하는 반면, S 도메인은 바이러스 RNA의 주위에 지지체를 형성한다. 박테리아에서 발현 될 때 P 도메인은 생물학적으로 중요한 이합체로 어셈블. 는 P d를IMER은 탄수화물 구조와 상호 작용, 타액에 용해 항원으로 존재하는 특정 숙주 세포 ^3에서 볼 수 있습니다 히스 - 혈액형 항원 (HBGAs를)라고. 는 P 도메인 HBGA의 상호 작용은 감염 ⁴ 중요한 것으로 생각된다. 사실, 최근의 보고서는 합성 HBGAs 또는 시험 관내 ⁵ 인간의 노로 바이러스 감염 박테리아를 HBGA가 발현의 중요성을 밝혔다.

noroviruses의 숙주 세포 부착에 관한 현재의 연구는 주로 곤충 세포 혹은 대장균 (대장균)에서 발현 된 재조합 P 도메인으로 표현 될 수있는 바이러스 입자 (VLP를)로 수행된다. 원 해상도의 P HBGA 도메인 상호 작용을 이해하기 위해, P-도메인 HBGA 복잡한 구조는 X 선 결정학을 이용하여 해결 될 수있다. 여기서, 우리는 높은 수량과 품질 P 도메인의 생산은 X 선 crystall 용으로 사용될 수 있도록 P 도메인 발현 및 정제를위한 프로토콜을 기술ography. 또한,이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역과 비 구조 단백질에 적용 할 수있다.

P 개의 도메인 E. 대한 코돈 최적화 대장균 발현과 표준 전송 벡터에 클로닝. P 개의 도메인이어서 폴리 히스티딘 (그의) 태그 및 프로테아제 절단 부위 다음된다 만노오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 발현 벡터로 재 클로닝된다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질로 표현 E. 대장균은 세 정제 단계 하였다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질은 고정화 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC)를 이용하여 정제한다. 다음에, 융합 단백질은 인간 리노 바이러스 (HRV) -3C 프로테아제 및 P 영역이 분리되어로 절단된다 MBP-그의 부가 IMAC 정제 단계에 의해. 마지막으로, P 도메인은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 이용하여 정제한다. 정제 된 P 영역은 X 선 결정학에 사용될 수있다. 단백질 결정화 조건의 스크리닝 PERFO 인다른 P 도메인 단백질 농도를 사용하여 시판의 스크리닝 키트 rmed. 결정 성장이 관찰되고, 가장 유망한 조건이 최적화된다.

방법은 여기에 설명과 함께, 그것은 미만 사주 내에서 구조화 단백질 유전자에서 갈 수 있습니다. 따라서, P 도메인의 발현, 정제, 결정화의 우리의 방법은 분자 수준에서 노로 바이러스 - 호스트 상호 작용을 연구하고 최신 백신 디자인 및 약물 검사를 지원하기 위해 중요한 데이터를 제공하기에 적합하다.

프로토콜

1. P 도메인 복제

1. 노로 바이러스 균주의 서열 정렬하여 P 도메인 코딩 영역을 결정합니다 (예를 들어, GII.10 변형, GenBank 등록 : AF504671, PDB-ID : 3ONU) ^6. 또한, P 영역 (도 2a)의 C 말단에있는가요 성 영역을 제거한다. E.위한 DNA를 코돈 - 최적화 대장균 발현 및 BamHI에 서브 클론을 위해 (터미널 N) 및 NotI을 (C 터미널) 제한 다음 사이트 pMalc2x 발현 벡터 ^6,7로 영역을 코딩 P 도메인을 포함한다.
   참고 : P 도메인 코딩 영역은 최적화 된 상용 서비스에 의해 합성된다. 지역 (삽입)를 코딩 P 도메인은 약 1 길이 킬로바이트 및 표준 전송 벡터에서 제공합니다.
2. 각각의 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)로 제한 제조업체 버퍼를 공급하여 37 ℃에서 1 시간 동안 효소로 전사 벡터의 2 μg의 다이제스트.
3. 1 % 아가로 오스 겔에서 분해 삽입 별개135 V에서 20 분 동안 시판 키트를 사용하여 겔로부터 삽입 DNA를 정제.
4. 각 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)에 제한은 37 ° C에서 1 시간 동안 효소로이 벡터의 2 μg의 소화하여 pMalc2x 발현 벡터를 준비한다. (1.3) 상술 한 바와 같이, 아가 로스 젤에서 벡터를 정제. 참고 : 두 샘플 (1.2 및 1.4)는 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
5. 실온 (RT) (그림 2B와 2C)에서 15 분 1 μL T4-DNA 리가 아제 (40 U / ㎖)와 BamHI 및 NotI에 제한 부위에서 절단 pMalc2x 벡터로 정제 인서트를 결찰. 삽입 비율 1 : 3 (분자량)를 pMalc2x 벡터와 벡터의 적어도 20 NG를 사용한다. 결찰 혼합물은 일반적으로 20 ~ μL이다.
6. 50 μL 화학적 관할 E.로 결찰 믹스 2㎕의 변형 대장균 DH5α 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 박테리아 세포 성장이 60037 ° C에서 1 시간 동안 ㎕의 SOC 배지. 원심 분리기는 형질 전환 된 세포는 1,000 XG에 3 분 동안, 상층 액을 제거하고, SOC 매체의 30 μL에 펠렛을 재현 탁.
   1. 선택에 100 ㎍ / ml 암피실린, LB 한천 플레이트 상 변환 혼합 플레이트, 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장한다. 적어도 다섯 식민지를 선택합니다.
7. 다섯 식민지의 각각에 대해, 50 μg의 / ㎖ 앰피 실린 (LB-A)로 보충 LB-매체의 2-3 ml의 문화를 접종하고 37 ℃에서 160 rpm으로 밤새 진탕 성장한다.
8. 상용 키트를 사용하여 야간 문화 플라스미드의 압축을 풉니 다. pMalc2x 정방향 프라이머 (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ')와 염기 서열에 의한 P 도메인 삽입의 존재를 확인하고 프라이머 역 (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

2. P 도메인 표현

1. MBP-그의-P 도메인에 대한 pMalc2x 벡터 코딩 - (400 NG / μL 150 NG / μL) 1 μl를 변환관할 E.의 50 μL에 융합 단백질 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 대장균 BL21 세포는 37 ° C에서 1 시간, 600 μL의 SOC 배지에서 자란다. 밤새 160 rpm으로 37 ° C에서 LB-A의 120 ml의에 하위 문화.
2. 차 배양 (100 일)와 LB-A의 (1.5 L 매체 각각 예를 들어, 6 × 5 L 플라스크) 구리터을 접종한다. 0.6 - 외경 _(600)가 0.4에 도달 할 때까지 160 rpm으로 37 ° C에서 진탕 세포 성장. 그 후, ~ 1 시간 동안 22 ° C까지 온도를 낮추고 다음 이소 프로필 β-D-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드의 0.66 밀리미터 (IPTG) ⁸ 단백질 발현을 유도. 하룻밤 22 ° C (~ 18 시간)에서 세포를 성장.
   온도는 다양 할 수 있지만, 우리는 22 ° C 이하를 사용하는 것이 좋습니다 있습니다.
3. 원심 분리 (10,543 XG, 15 분, 4 ° C)에 세​​포를 수확. 뜨는을 취소하고 -20 ° C에서 세포 펠렛을 동결.

3. ^{1 차} 정제 단계 및 프로테아제 절단

1. 실험의 재현성 및 안정성을 보장하기 위해 재고 솔루션에서 단백질 정제 단계 동안 사용되는 버퍼를 준비합니다. 고정 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피에 대 한 4 개의 서로 다른 버퍼 (IMAC), 이미 다졸의 다른 농도를 포함하는 각 (10 밀리미터, 20 밀리미터, 50 밀리미터, 250 밀리미터)를 준비합니다. SEC에 대해보다 높은 염 농도와 겔 여과 완충액 (GFB)을 제조하지만, 이미 다졸없이. 탈 이온수를 사용하여 0.45 ㎛의 공극 크기를 사용하기 전에 모든 버퍼를 필터링.
   참고 : 자세한 버퍼 준비 방식은 표 1을 참조하십시오.
2. 아홉 리터의 문화에서 세포 펠렛을 해동하고 4 ° C에서 150 ml의 PBS에 용해. 세포를 파괴하는 세포 현탁액을 2 분 (파워 130 W, 20 %의 진폭, 펄스 주파수 50 %) 3 회 초음파 처리. 초음파 동안 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
3. CentrifuGE는 초음파 세포 현탁액 (43,667 × g으로 30 분, 39 ° C에서)이 발현 된 단백질을 함유하는 상청액으로부터 세포 찌꺼기를 분리한다. 상층 액을 수집하고 펠렛을 폐기합니다.
4. 세척 및 니켈 (Ni) 크로마토 그래피 컬럼에서 10 mM의 이미 다졸 버퍼 -NTA 아가 로스 비드 10 ㎖ (= 1 열 볼륨 [CV]) 슬러리를 평형. 단계 3.3에서 뜨는로 평형 니켈 구슬을 추가 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 발현 느린 회전 4 ° C에서 30 분 동안 품어 함유.
5. 배양 후, 크로마토 그래피 컬럼에 전체 니켈 비드 단백질 혼합물을 적용합니다. 10 밀리미터, 20 밀리미터, 10 밀리미터, 다음 20 mM의 마지막 50 밀리미터 (그림 3A)로 시작하는 50 mM의 이미 다졸 버퍼, 각각 5 이력서와 함께 천천히 열을 씻으십시오.
6. 250 mM의 이미 다졸 완충액 (도 3a)을 사용하여 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 용출시켰다. 용출 동안에, 융합 단백질의 용출 (OD _(28)의 증가를 확인 OD를 _{280 ㎚를} 점검를 0㎚). 외경의 _{280 ㎚가} ~ 0.1에 떨어질 때까지 용출을 계속합니다. 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 적어도 10 약력이어서 250 mM의 이미 다졸 완충액 (적어도 10 CV들) 과량으로 비드를 세척 하였다. 두 번째 정제 단계 (섹션 4)의 구슬을 저장합니다.
7. 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (10 × 8cm) ⁽⁹⁾ (도 3A)을 이용하여 SDS-PAGE로 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질의 존재를 확인한다. 45에서 겔 전기 영동을 수행하고 45 분 동안 200 V.
8. ~ 3 mg / ml의 최종 농도로 (상업적 농축기를 사용하여, 예) 용출 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 농축시킨다. (~ 1 : 100)을 10 mm의 2 L에 대해 투석하는 동안 이미 다졸 버퍼를 HRV-3C 프로테아제와 MBP-그의-P 도메인 융합을 절단 밤새 4 ° C (도 3A)에서. 농축 된 단백질의 최종 부피에 따라 투석 카세트 또는 투석 튜브로 투석을 수행한다.
   주 : 단백질 HRV-3C 단백질 분해 효소의 양은분열은 특정 프로테아제 활성에 따라 계산되고, 발현 량에 변화하고, SDS-PAGE의 결과로부터 추정 될 수 용출 된 융합 단백질의 양 (3.7 (2 U / ㎕의 1 U 100 단백질 μg의을 절단하기에 충분하다) ).

4. 2 ^{차 정화} 단계

1. 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 단계 3.6에서 니켈 구슬 평형.
2. 느린 회전으로 ​​39 ° C에서 30 분 동안 평형화 니켈 비드 (4.1)와 (P 절단 도메인 MBP 단백질 및 HRV 프로테아제 함유)을 단계 3.7에서 투석 된 단백질을 부화.
3. 컬럼에 니켈 비드 혼합물을 적용하고 흐름을 통해 (절단 P 도메인) (그림 3B)를 수집합니다. 외경의 _{280 ㎚가} ~ 0.1에 도달 할 때까지 열을 벗기으로 단백질 농도를 측정한다.
   참고 : MBP-그분은 니켈 구슬 (그림 3B)에 결합 된 상태로 유지해야합니다.
4. 1과 함께 SDS-PAGE를 이용하여 절단 된 P 영역의 존재를 확인2 % 겔은 다음과 같이 (도 3b) 상술. ~ 3 ㎎ / ㎖로 용출 P 도메인을 집중 이후 SEC의 정제 GFB에 대한 4 ° C에서 하룻밤 투석.

제 ^{3 차} 정제 단계

1. 세척 펌프 및 HPLC 정화 시스템의 파이프 및 사전 평형 증권 거래위원회 (SEC) 열을 GFB와 (자료 목록 참조).
2. 농축 된 시료의 양에 따라, 1 ㎖ (3 ㎖까지)을 superloop (최대 12 ㎖) 또는 루프를 사용 / 분의 유속으로 컬럼에 P 도메인을 주입한다. 분사가 완료되면 / 분으로 2.5 ml의 유량을 증가시킨다.
3. 외경이 증가하고, P 도메인 열 벗기 같이, 1.5 ㎖로 분획을 수집한다. 12 % 겔 SDS-PAGE를 이용하여 분획을 확인 (도 4a 및도 4b). 수영장 만 순수한 분수와 ~ 3 ㎎ / ㎖하고 ~ 8 ㎎ / ㎖에 집중한다.
   참고 : 110 ~ 후 ㎖ (공극 부피) 대부분의 불순물이 320 ml의 침대 볼륨과 SEC 컬럼에서 용출됩니다. 그만큼P 도메인은 일반적으로 이량 체로서 용출된다. 는 P 도메인 이량 체의 용출 시간 / 볼륨은 SEC 컬럼의 사전 등급 (PG)에 따라 달라집니다.

는 P 도메인 6. 결정화

1. 초기 결정화 스크리닝 ~ 3 ㎎ / ㎖, 8 ㎎ / ㎖에서 P 도메인을 사용합니다. 384 시중에서 판매하는 선별 조건을 초기 화면에 대한 농도 별 P 도메인의 최소 100 μl를 준비합니다. 리저버 어머니 용액 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트 형식에서 18 ° C에서 스크리닝을 수행하고 드롭 0.2 μL 머더 용액 0.2 μL 단백질로 구성된다.
2. 반복 성공적으로 결정화 조건을 최적화 할 수 있습니다. 따라서, 3 행을 포함 15 웰 플레이트를 사용합니다. 100 % 어머니 솔루션, 90 %의 어머니 용액과 10 %의 물과 80 %의 어머니 용액과 20 %의 물과 세 번째 행과 두 번째 행과 첫 번째 행을 설정합니다. 2 μL (1 μL 단백질 + 1 μl의 어머니 용액) 500의 방울 크기를 사용하여81, 저수지 볼륨으로 어머니 솔루션의 리터.
3. 공 결정화 리간드와 P 도메인에 최적화 된 결정 조건을 사용합니다. 6.2에 설명 된대로 판을 준비합니다. 대신에 2 ㎕의 방울 크기, 1 μL 모 용액 1 ㎕의 단백질 및 1 ㎎ / ㎖ 농도의 리간드 1 μl를 함유 방울을 설정.
4. 싱크로트론 방사선을 이용한 단결정의 데이터 세트를 수집한다. 초기 탐색 모델 ^6,10-13 같은 높은 서열 유사성과 출판 P 도메인 구조를 이용하여 분자량 교환을 수행한다.
   참고 : 리간드의 존재는 전자 밀도의 취소 모델링 덩어리로 표시됩니다.

결과

기술 된 프로토콜의 개략도가도 2. 프로토콜은 표적 유전자의 클로닝, 발현, 세 단계의 정제 및 결정화 포함 6 주요 부분을 포함한다.도 1에 도시 된 식 구조의 설계를 도시한다 (EC) 및 pMalc2x 발현 벡터의 특징. pMalc2x 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS)의 순서는 제한 프로테아제 절단 부위를 나타낸다.도 3은 제 두개의 대응하는 회로도와 MBP-...

토론

여기, 우리는 높은 품질과 수량에서 노로 바이러스의 P 도메인의 발현 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. Noroviruses 잘 연구되지 ​​않고 구조적 데이터가 지속적으로 필요하다. 우리의 지식에, 다른 프로토콜 (예를 들면, GST 태그가 P 영역)을 이용하여 P 영역 생성은 지금까지 문제가되고 있으며, 노로 바이러스 호스트 상호 작용에 충분한 구조적 데이터가 누락되어있다. 방법은 여기에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products