Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in<em&gt; E. coli</em&gt; Für Röntgenkristallographie

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zum Ausdruck bringen und eine hohe Qualität Norovirus vorstehende (P) Domänen in E. reinigen coli für die Verwendung in der Röntgenkristallographie Studien. Dieses Verfahren kann auf andere Calicivirus P Domänen angewendet werden, sowie Nicht-Strukturproteine, dh., Virales Protein - Genom-linked (VPg), Protease und RNA - abhängige RNA - Polymerase (RdRp).

Zusammenfassung

Die Norovirus-Kapsid eines einzigen großen strukturellen Protein zusammengesetzt ist, bezeichnet VP1. VP1 in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne unterteilt. Die S-Domäne bildet eine zusammenhängende Gerüst um die virale RNA, während die P-Domäne Formen viraler Spitzen auf der S-Domäne enthält und Determinanten für die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen. Die P - Domäne bindet Kohlenhydratstrukturen, dh., Histo-Blutgruppenantigene, die für Norovirus - Infektionen wichtig sind gedacht zu sein. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode für hochwertige Norovirus P-Domänen in hohen Ausbeuten herzustellen. Diese Proteine ​​können dann für die Röntgenkristallographie und ELISA verwendet werden, um die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen zu studieren.

Die P-Domäne wird zuerst in einen Expressionsvektor kloniert und exprimiert dann in Bakterien. Das Protein wird gereinigt drei Schritte ausführen, die Metall-Ionen-Affinitätschromatographie und Grßenausschlußchromatographie immobilisiert beinhalten. ImGrundsätzlich ist es möglich, zu klonen, Express, zu reinigen und zu kristallisieren Proteine ​​in weniger als vier Wochen, die in diesem Protokoll zur Analyse von neu entstehenden Norovirus-Stämme ein schnelles System macht.

Einleitung

Menschliche Noroviren sind die Hauptursache der akuten Gastroenteritis weltweit ^1. Diese Viren gehören zur Familie der Caliciviridae, von denen es mindestens fünf Gattungen, einschließlich Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus und Nebovirus. Trotz ihrer hohen Einfluss auf das Gesundheitssystem und die weite Verbreitung, die Untersuchung der menschlichen noroviruses wird durch das Fehlen eines stabilen Zellkultursystem behindert. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder antivirale Strategien zur Verfügung.

Das Norovirus Hauptkapsidprotein, genannt VP1, kann in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne ² geteilt werden. Die P-Domäne wird durch ein flexibles Scharnier (H) Region der S-Domäne verbunden. Die S-Domäne bildet ein Gerüst, um die Virus-RNA, während die P-Domäne den äussersten Teil des viralen Capsid bildet. Die P-Domäne versammelt in biologisch relevanten Dimere, wenn sie in Bakterien exprimiert. Die P dimer mit Kohlenhydratstrukturen in Wechselwirkung tritt, bezeichnet als histo-Blutgruppenantigene (HBGAs) , die als lösliche Antigene im Speichel vorhanden sind und auf bestimmte Wirtszellen ³ gefunden. Die P domain-HBGA Interaktion wird gedacht für Infektions ⁴ wichtig. Tatsächlich ergab eine kürzlich veröffentlichten Bericht die Bedeutung von synthetischen HBGAs oder Bakterien , die für die menschliche Norovirus - Infektion in vitro ⁵ HBGA-Ausdruck zu bringen.

Aktuelle Studien der Wirtszelle Befestigung noroviruses Bezug hauptsächlich mit virusähnlichen Partikeln (VLPs) durchgeführt , die in Insektenzellen oder die mit rekombinanten P Domänen exprimiert in Escherichia coli (E. coli) exprimiert werden kann. Um zu verstehen, können die P-Domäne-HBGA Wechselwirkungen auf atomarer Ebene, P Domain-HBGA komplexe Strukturen werden Röntgenkristallographie gelöst werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die P-Domäne Expression und Reinigung, die für Röntgen Crystall verwendet Produktion von P-Domäne in hoher Quantität und Qualität werden könnengraphie. Außerdem kann dieses Verfahren für andere Calicivirus P-Domänen und nicht-strukturelle Proteine ​​angewendet werden.

Die P - Domäne wird Codon-optimiert für E. coli - Expression und in einem Standard - Transfer - Vektor geklont. Die P-Domäne wird dann in einen Expressionsvektor re-kloniert, das einen Polyhistidin (His) Markierung und ein Mannose-bindendes Protein (MBP), die durch eine Protease-Spaltstelle gefolgt werden codiert. Das MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein wird in E. ausgedrückt coli, durch drei Reinigungsschritten gefolgt. Das MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein wird unter Verwendung von immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). Als nächstes wird das Fusionsprotein mit humanem Rhinovirus (HRV) -3C Protease gespalten und die P-Domäne von MBP-His durch eine zusätzliche IMAC-Reinigungsschritt abgetrennt wird. Schließlich wird die P-Domäne unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt. Das gereinigte P-Domäne können dann für die Röntgenkristallographie verwendet werden. Screening von Proteinkristallisationsbedingungen ist perfoRMED mit im Handel erhältlichen Screening-Kits unterschiedliche P Domäne Proteinkonzentrationen verwendet wird. Kristallwachstum beobachtet und die vielversprechendste Bedingungen optimiert sind.

Mit den hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, vom Gen zum Protein zu gehen innerhalb von weniger als vier Wochen zu strukturieren. Deshalb ist unsere Methode der P Domain Expression, Reinigung und Kristallisation eignet Norovirus-Wirt-Interaktion auf molekularer Ebene zu untersuchen und wichtige Daten liefern zu unterstützen, up-to-date Impfstoff-Design und Wirkstoff-Screening.

Protokoll

1. P Domain Cloning

1. Bestimmen Sie die P - Domäne kodierende Region durch Sequenzabgleich von Norovirus - Stämme (zB GII.10 Stamm, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) ^6. Außerdem entfernen die flexible Region am C-terminalen Ende der P - Domäne (2A). Codonspezifische Optimierung der DNA für E. coli - Expression und umfassen BamHI (N-terminal) und NotI (C-terminal) Restriktionsstellen , um Sub-Klon der P - Domäne kodierende Region in den pMalc2x Expressionsvektor ^6,7.
   Hinweis: Der P-Domäne codierende Region wird optimiert und durch einen kommerziellen Service synthetisiert. Die P-Domäne kodierende Region (Einsatz) beträgt etwa 1 kb in der Länge und in einem Standard-Transfervektor geliefert.
2. Digest 2 ug des Transfervektors mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C mit einer vom Hersteller gelieferten Puffer.
3. Trennen Sie die verdaute Einsatz auf einem 1% Agarosegelfür 20 min bei 135 V und reinigen die Insert-DNA aus dem Gel unter Verwendung eines kommerziellen Kits.
4. Bereiten Sie die pMalc2x Expressionsvektor von 2 ug dieses Vektors Digerieren mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C. Reinige den Vektor aus einem Agarosegel, wie oben beschrieben (1,3). Anmerkung: Beide Proben (1,2 und 1,4) bei -20 ° C gelagert werden.
5. Ligieren des gereinigten Inserts in dem verdauten Vektor pMalc2x an den BamHI- und NotI - Restriktionsstellen mit 1 ul T4-DNA - Ligase (400.000 U / ml) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) (2B und 2C). Verwenden Sie mindestens 20 ng des pMalc2x Vektor und einem Vektor: Insert Verhältnis 1: 3 (Molekulargewicht). Die Ligationsmix ist in der Regel ~ 20 & mgr; l.
6. Transformieren 2 & mgr; l der Ligationsmischung in 50 & mgr; l chemisch kompetente E. coli DH5a Bakterienzellen ein Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 Sekunden bei 42 ° C) und wachsen in 600 unter Verwendung von& mgr; l SOC-Medium für 1 Stunde bei 37 ° C. Centrifuge die transformierten Zellen für 3 min bei 1000 · g, den Überstand verwerfen und das Pellet in 30 & mgr; l SOC-Medium.
   1. Platte der Transformationsmischung auf LB-Agar-Platten, 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion enthält, und wachsen über Nacht bei 37 ° C. Wählen Sie mindestens fünf Kolonien.
7. Für jede der fünf Kolonien inokulieren 2-3 ml Kultur von LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Ampicillin (LB-amp) und wachsen über Nacht bei 160 rpm bei 37 ° C schüttelnd.
8. Extrahieren Sie die Plasmide, die aus der über Nacht Kultur eines kommerziellen Kits verwenden. Überprüfen Sie das Vorhandensein der P-Domäne Einsatz durch Sequenzierung mit einem pMalc2x Forward-Primer (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') und Reverse-Primer (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

2. P Domain Expression

1. Transformieren 1 ul (150 ng / ul - 400 ng / & mgr; l) des pMalc2x Vektors kodierend für das MBP-His-P domainFusionsproteins in 50 ul kompetenten E. coli BL21 Zellen eine Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 sec bei 42 ° C) verwendet und bei 37 ° C für 1 Stunde in 600 & mgr; l SOC - Medium wachsen. Subkultur in 120 ml LB-amp über Nacht bei 160 rpm und 37 ° C.
2. Beimpfen von neun Litern (beispielsweise 6 x 5 L Kolben mit 1,5 l Medium jeweils) von LB-amp mit der Subkultur (1: 100). Wachsen die Zellen bei 160 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C schütteln , bis die OD ₆₀₀ 0,4 erreicht - 0,6. Anschließend wird für ca. 1 Stunde die Temperatur auf 22 ° C abzusenken und dann mit 0,66 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ⁸ , um die Proteinexpression induzieren. Wachsen die Zellen über Nacht bei 22 ° C (~ 18 h).
   Hinweis: Die Temperatur variiert werden kann, aber wir empfehlen 22 ° C oder weniger zu verwenden.
3. Ernte der Zellen durch Zentrifugation (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Überstand verwerfen und frieren das Zellpellet bei -20 ° C.

3. ^1. Reinigungsschritt und Protease - Spaltung

1. Bereiten Puffer, die während der Proteinreinigungsschritte aus Stammlösungen verwendet werden, die Reproduzierbarkeit und die Stabilität der Experimente zu gewährleisten. Bereiten vier verschiedenen Puffern für die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC), die jeweils eine andere Konzentration an Imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM und 250 mM). Für die SEC, bereiten Sie einen Gelfiltrationsexperimente Puffer (GFB) mit einer höheren Salzkonzentration, jedoch ohne Imidazol. Verwenden deionisiertem Wasser und filtern alle Puffer vor Verwendung mit einer Porengröße von 0,45 um.
   Hinweis: Für eine detaillierte Pufferherstellungsschema finden Sie in Tabelle 1.
2. Auftauen des Zellpellets aus der neun Liter Kultur und lösen sich bei 4 ° C in 150 ml PBS. Beschallen die Zellsuspension dreimal für 2 min (Leistung 130 W, 20% Amplitude, Impulsfrequenz 50%) der Zellen zu stören. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis während der Beschallung.
3. Centrifuge Die beschallte Zellsuspension (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) aus dem Überstand von Zelltrümmern zu trennen exprimierte Protein enthält. Sammeln Sie den Überstand und das Pellet verwerfen.
4. Wash und 10 ml (= 1 Säulenvolumen [CV]) Schlamm aus Nickel (Ni) -NTA Agarose-Kügelchen mit 10 mM Imidazol-Puffer in einer Chromatographiesäule äquilibrieren. Fügen Sie die äquilibrierte Ni-Perlen zu dem Überstand aus Stufe 3.3, enthaltend exprimierten MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein und Inkubieren für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation.
5. Nach der Inkubation gelten für eine Chromatographiesäule die gesamte Ni-bead-Proteinmischung. Die Säule wird langsam mit je 5 CVs von 10 mm, 20 mm und 50 mM Imidazol - Puffer mit 10 mM beginnen, dann 20 mM und letzten 50 mM (3A).
6. Eluieren die MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein unter Verwendung von 250 mM Imidazol - Puffer (3A). Während der Elution, überprüfen Sie die OD _280nm die Elution des Fusionsproteins zu überprüfen (der Anstieg der OD ₂₈0nm). Weiterhin Elution , bis die OD _280nm zu Tropfen ~ 0,1. Waschen der Kügelchen mit übermäßiger Mengen von 250 mM Imidazol-Puffer (mindestens 10 CVs), gefolgt von mindestens 10 CVs von 10 mM Imidazol-Puffer. Speichern Sie die Perlen für die zweite Reinigungsstufe (Abschnitt 4).
7. Überprüfen die Anwesenheit des MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein mit SDS-PAGE unter Verwendung eines 12% SDS-Polyacrylamidgel (10 x 8 cm) ⁹ (3A). Führen Sie Gel-Elektrophorese bei 45 A und 200 V für 45 min.
8. Konzentrat (beispielsweise eine kommerzielle Konzentrator verwendet wird ) das eluierte MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein zu einer Endkonzentration von ~ 3 mg / ml. Spalten die MBP-His-P Domäne Fusion mit HRV-3C - Protease während der Dialyse gegen 2 l 10 mM Imidazol - Puffer (~ 1: 100) über Nacht bei 4 ° C (Abbildung 3A). Je nach Endvolumen von konzentriertem Protein, führen Dialyse in einer Dialysekassette oder Dialyseschlauch.
   Anmerkung: Die Menge der HRV-3C-Protease für die ProteinSpaltung berechnet wird entsprechend der spezifischen Protease-Aktivität (2 U / & mgr; l, 1 U ist ausreichend, um 100 ug Protein abzuspalten) und der Menge des eluierten Fusionsproteins, die auf dem Expressionsniveau variiert und kann aus dem SDS-PAGE-Ergebnis (3.7 abschätzbar ).

4. ^2. Reinigungsschritt

1. Äquilibrieren die Ni-Perlen aus Schritt 3.6 in 10 Imidazolpuffers mM.
2. Inkubieren der dialysierten Protein aus Schritt 3.7 mit den äquilibriert Ni-beads (4.1) für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation (gespalten P domain, MBP-Protein und HRV-Protease enthält).
3. Tragen Sie die Ni-Perlen - Mischung auf eine Säule und sammeln Sie die Flow-Through (gespalten P - Domäne) (3B). Messen Sie die Konzentration des Proteins , wie es die Spalte , bis die OD _{280 nm} erreicht ~ 0.1 kommt weg.
   Hinweis: Das MBP-His sollte die Ni-beads (3B) gebunden bleiben.
4. Prüfen Sie das Vorhandensein von gespaltenen P-Domäne unter Verwendung von SDS-PAGE mit einem 12% Gel , wie oben (3B) beschrieben. Konzentrieren der eluierten P Domäne ~ 3 mg / ml und dialysiere über Nacht bei 4 ° C gegen GFB für nachfolgende SEC Reinigung.

5. ^3. Reinigungsschritt

1. Waschpumpen und Leitungen der HPLC-Reinigungsanlage und Pre-äquilibrieren der SEC-Säule (siehe Materialliste) mit GFB.
2. Injizieren der P-Domäne auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min eine Superloop (bis zu 12 ml) oder Schleife (bis zu 3 ml), je nach dem Volumen der konzentrierten Probe. Nach der Injektion abgeschlossen ist, erhöhen auf 2,5 ml / min Volumenstrom.
3. Da die OD erhöht und die P-Domäne aus der Säule kommt, sammeln Fraktionen von 1,5 ml. Überprüfen Fraktionen mittels SDS-PAGE mit einem 12% -Gel (4A und 4B). Pool nur die reinsten Fraktionen und konzentriere auf ~ 3 mg / ml und ~ 8 mg / ml.
   Hinweis: Nach ~ 110 ml (Hohlraumvolumen) die meisten Verunreinigungen aus einer SEC-Säule mit 320 ml Bettvolumen eluiert werden. DasP-Domäne wird in der Regel als ein Dimer eluiert. Elutionszeit / Volumen der P-Domäne Dimer ist abhängig von der Präparationsgüte (pg) der SEC-Säule.

6. Die Kristallisation des P-Domäne

1. Verwenden, um die P-Domäne bei ~ 3 mg / ml und 8 mg / ml für die anfängliche Kristallisation Screening. Bereiten Sie mindestens 100 & mgr; l P-Domäne pro Konzentration für Einstiegsbildern mit 384 im Handel erhältlichen Screening-Bedingungen. Screening bei 18 ° C in einer 96-Well-Plattenformat, in dem der Vorratsbehälter enthält 100 & mgr; l Stammlösung und ein Tropfen besteht aus 0,2 & mgr; l Stammlösung und 0,2 & mgr; l Protein.
2. Wiederholen und optimieren erfolgreiche Kristallisationsbedingungen. Daher verwenden 15-Well-Platten, die 3 Zeilen enthalten. Stellen Sie die erste Zeile mit 100% Mutterlösung auf, die zweite Reihe mit 90% Stammlösung und 10% Wasser, und die dritte Reihe mit 80% Stammlösung und 20% Wasser. Verwenden Sie eine Tropfengröße von 2 & mgr; l (1 ul Protein + 1 & mgr; l Stammlösung) und 50081; l der Mutterlösung als Behältervolumen.
3. Verwenden Sie optimierte Kristall Bedingungen für die Co-Kristallisation des P-Domäne mit Liganden. Bereiten Platten wie in 6.2 beschrieben. Anstelle von 2 ul Tropfengröße eingesetzten Tropfen, die 1 & mgr; l Mutterlösung, 1 & mgr; l Protein und 1 ul-Ligand in einer Konzentration von 1 mg / ml.
4. Sammeln Sie Datensätze von Einkristallen mit Synchrotronstrahlung. Führen des molekularen Ersatzes unter Verwendung veröffentlichter P Domänenstrukturen mit einer hohen Sequenzähnlichkeit als erste Suche Modell ^6,10-13.
   Hinweis: Die Anwesenheit eines Liganden zeigt sich als nicht modellierte blob der Elektronendichte.

Ergebnisse

Die schematische Darstellung der beschriebenen Protokoll ist in 1 dargestellt. Das Protokoll 6 Hauptteile umfasst , die Klonierung des Zielgens die Expression umfassen einen dreistufigen Reinigung und Kristallisation. 2 veranschaulicht die Konstruktion des Expressionskonstrukts (EC) und Eigenschaften des pMalc2x Expressionsvektor. Die Sequenz der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des pMalc2x Vektor zeigt Restriktions und Proteasespaltstellen. Abb...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Expression und Reinigung von Norovirus P-Domänen in hoher Qualität und Quantität. Noroviren sind nicht gut untersucht und Strukturdaten werden kontinuierlich benötigt. Unseres Wissens P Domain Produktion mit anderen Protokollen (zB GST-tagged P - Domänen) war problematisch, so weit, und eine ausreichende strukturelle Daten auf Norovirus-Wirt - Interaktion gefehlt haben. Mit dem hier beschriebenen Verfahren haben wir in letzter Zeit wesentlich zum Verständnis der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products