Production de l&#39;homme Norovirus SAILLANTES Domaines dans<em&gt; E. coli</em&gt; Pour X-ray Crystallography

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer et purifier les norovirus de haute qualité en saillie (P) dans les domaines E. coli pour une utilisation dans les études de cristallographie aux rayons X. Cette méthode peut être appliquée à d' autres domaines calicivirus P, ainsi que des protéines non structurales, à savoir., Protéines du génome viral lié (VPg), la protéase et l' ARN polymérase dépendante de l' ARN (RdRp).

Résumé

La capside norovirus est constituée d'une seule protéine structurale majeure, appelée VP1. VP1 est subdivisé en une coque (S) et un domaine en saillie (P) domaine. Le domaine S forme un échafaudage contiguë autour de l'ARN viral, tandis que les formes P de domaine de pointes virales sur le domaine S et contient déterminants pour les interactions d'antigénicité et de la cellule hôte. Le domaine P se lie structures d' hydrates de carbone, ie., Les antigènes du groupe histo-sang, qui sont considérés comme importants pour les infections à norovirus. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé de production norovirus P domaines de haute qualité avec des rendements élevés. Ces protéines peuvent alors être utilisées pour la cristallographie aux rayons X et ELISA afin d'étudier les interactions d'antigénicité et de la cellule hôte.

Le domaine P est d'abord clone dans un vecteur d'expression et exprimé dans des bactéries. La protéine est purifiée en utilisant trois étapes qui consistent à immobilisés Chromatographie d'affinité d'ions métalliques et une Chromatographie d'exclusion de taille. Dansprincipe, il est possible de cloner, exprimer, purifier et cristalliser les protéines en moins de quatre semaines, ce qui rend ce protocole, un système rapide pour analyser les nouvelles souches émergentes de norovirus.

Introduction

Les norovirus humains sont la principale cause de gastro - entérite aiguë dans le monde ^1. Ces virus appartiennent à la famille Caliciviridae, dont il existe au moins cinq genres, y compris les norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus et Nebovirus. En dépit de leur fort impact sur le système de santé et une large distribution, l'étude des norovirus humains est entravée par l'absence d'un système de culture cellulaire robuste. À ce jour, il n'y a pas de vaccins approuvés ou stratégies antivirales disponibles.

La protéine majeure de capside norovirus, appelé VP1, peut être divisé en une coque (S) et un domaine en saillie (P) domaine ^2. Le domaine P est connecté au domaine S par une région charnière flexible (H). Le domaine S forme un échafaudage autour de l'ARN viral, alors que le domaine P constitue la partie la plus extérieure de la capside virale. Le domaine P assemble en dimères biologiquement pertinentes lorsqu'elle est exprimée dans des bactéries. P dimer interagit avec les structures d'hydrates de carbone, appelés antigènes des groupes sanguins (histo-HBGA) qui sont présents comme des antigènes solubles dans la salive et dans certaines cellules hôtes ^3. Le P domain-HBGA interaction est considéré comme important pour l' infection ^4. En effet, un rapport récent a révélé l'importance de HBGA synthétiques ou HBGA exprimant des bactéries pour l' infection à norovirus humain in vitro ^5.

Les études actuelles concernant la fixation de la cellule hôte de norovirus sont principalement réalisées avec des particules de type virus (VLP) qui peuvent être exprimées dans des cellules d' insectes ou des domaines P recombinants exprimés dans Escherichia coli (E. coli). Pour comprendre les interactions P domaine HBGA à résolution atomique, des structures complexes P domaine-HBGA peuvent être résolus en utilisant cristallographie aux rayons X. Ici, nous décrivons un protocole pour l'expression P de domaine et de purification qui permet la production de P domaine en grande quantité et de la qualité à utiliser pour crystall X-rayography. En outre, cette méthode peut être appliquée à d'autres domaines calicivirus P et les protéines non structurales.

Le domaine P est le codon-optimisé pour E. expression coli et clone dans un vecteur de transfert standard. Le domaine P est ensuite re-cloné dans un vecteur d'expression qui code pour une polyhistidine (His) marqueur et une protéine de liaison au mannose (MBP), qui sont suivies par un site de clivage de protéase. MBP-His-protéine P domaine de fusion est exprimé dans E. coli, suivie par trois étapes de purification. La protéine de fusion MBP-domaine His-P est purifié en utilisant une Chromatographie d'affinité d'ions métalliques immobilisés (IMAC). Ensuite, la protéine de fusion est clivée par le rhinovirus humain (HRV) -3C protéase et le domaine P est séparé de la MBP-His par une étape supplémentaire de purification IMAC. Enfin, le domaine P est purifié en utilisant une Chromatographie d'exclusion de taille (SEC). Le domaine P purifié peut ensuite être utilisé pour la cristallographie aux rayons X. Dépistage des conditions de cristallisation des protéines est performé avec des kits de dépistage disponibles dans le commerce en utilisant différentes concentrations de protéine P de domaine. La croissance cristalline est observée et les conditions les plus prometteuses sont optimisées.

Avec les procédés décrits ici, il est possible de passer de gène à la protéine à la structure en moins de quatre semaines. Par conséquent, notre méthode d'expression P de domaine, la purification et la cristallisation est approprié pour étudier l'interaction norovirus-hôte au niveau moléculaire et de fournir des données importantes pour aider à la conception et la drogue dépistage mise à jour vaccin.

Protocole

1. P Domain Cloning

1. Déterminer la région P domaine de codage par alignement de séquences des souches de norovirus (par exemple, la souche GII.10, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) ^6. En outre, retirer la région flexible à l'extrémité C-terminale du domaine P (figure 2A). Optimiser les codons d' ADN pour E. expression coli et comprennent BamHI (N-terminal) et Notl (C-terminal) des sites de restriction afin de sous-clone le domaine P région codante dans le vecteur d'expression pMalc2x ^6,7.
   Remarque: La région P domaine de codage est optimisé et synthétisé par un service commercial. Le P domaine région codante (insert) est d'environ 1 kb de longueur et livré dans un vecteur de transfert standard.
2. Digest 2 ug du vecteur de transfert avec chaque 1 ul de BamHI (20 000 U / ml) et Notl (10 000 U / ml) les enzymes de restriction pendant 1 heure à 37 ° C avec du fabricant fourni tampons.
3. Séparer l'insert digéré sur un gel d'agarose à 1%pendant 20 min à 135 V et de purifier l'ADN d'insertion à partir du gel en utilisant un kit commercial.
4. Préparer le vecteur d'expression pMalc2x par digestion de 2 ng de ce vecteur à chaque 1 ul de BamHI (20 000 U / ml) et Notl (10 000 U / ml) les enzymes de restriction pendant 1 heure à 37 ° C. Purifier le vecteur d'un gel d'agarose comme décrit ci-dessus (1.3). Remarque: Les deux échantillons (1.2 et 1.4) peuvent être conservés à -20 ° C.
5. Ligaturer l'insert purifié dans le vecteur digéré pMalc2x au niveau des sites de restriction BamHI et Notl avec 1 pl de T4 ADN ligase (400 000 U / ml) pendant 15 min à température ambiante (TA) (figure 2B et 2C). Utilisez au moins 20 ng du vecteur pMalc2x et un vecteur: rapport d'insertion 1: 3 (poids moléculaire). Le mélange de ligature est habituellement ~ 20 pi.
6. Transformer 2 pi du mélange de ligature dans E. 50 pi chimiquement compétente coli DH5a Les cellules bactériennes en utilisant un protocole de transformation standard (10 min sur la glace, le choc thermique de 45 sec à 42 ° C) et croître en 600milieu SOC ul pendant 1 heure à 37 ° C. Centrifuger les cellules transformées pendant 3 min à 1000 xg, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 30 ul de milieu SOC.
   1. Plate mélange de transformation sur des plaques LB-Agar, contenant 100 ug / ml d'ampicilline pour la sélection, et faire croître une nuit à 37 ° C. Sélectionnez au moins cinq colonies.
7. Pour chacune des cinq colonies, inoculer 2-3 ml culture de milieu LB additionné de 50 pg / ml d'ampicilline (LB-amp) et de grandir en agitant pendant une nuit à 160 tours par minute à 37 ° C.
8. Extraire les plasmides à partir de la culture d'une nuit en utilisant un kit commercial. Vérifier la présence de l'insert P de domaine par séquençage avec une amorce directe pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') et l'amorce inverse (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

Expression 2. P Domain

1. Transformer 1 pi (150 ng / pl - 400 ng / ul) du vecteur codant pour la MBP pMalc2x-His-P domaineune protéine de fusion dans 50 pi de E. compétente cellules coli BL21 en utilisant un protocole de transformation standard (10 min sur la glace, le choc thermique de 45 sec à 42 ° C) et croître dans un milieu SOC 600 pi pendant 1 heure à 37 ° C. Subculture dans 120 ml de LB-amp pendant une nuit à 160 tours par minute et 37 ° C.
2. Inoculer neuf litres (par exemple, 6 x 5 L flacons avec 1,5 milieu L chacune) de LB-ampli avec la sous - culture (1: 100). Cultiver les cellules sous agitation à 160 tours par minute et 37 ° C jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ atteigne 0,4 à 0,6. Par la suite, abaisser la température à 22 ° C pendant environ 1 heure et ensuite induire l'expression de la protéine avec 0,66 mM d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ^8. Cultiver les cellules pendant la nuit à 22 ° C (environ 18 heures).
   Remarque: La température peut varier, mais il est recommandé d'utiliser 22 ° C ou moins.
3. Récolter les cellules par centrifugation (10.543 x g, 15 min, 4 ° C). Jeter le surnageant et congeler le culot cellulaire à -20 ° C.

3. 1 ^er étape de purification et Protease Décolleté

1. Préparation des tampons qui sont utilisés lors des étapes de purification de protéines à partir de solutions mères pour garantir la reproductibilité et la stabilité des expériences. Préparer quatre tampons différents pour la chromatographie d'affinité d'ions métalliques immobilisés (IMAC), contenant chacune une concentration différente de l'imidazole (10 mM, 20 mM, 50 mM et 250 mM). Pour la SEC, la préparation d'un tampon de filtration sur gel (BBBB), avec une concentration plus élevée en sel, mais sans imidazole. Utiliser de l'eau déminéralisée et filtrer tous les tampons avant l'utilisation avec une taille de pores de 0,45 pm.
   Remarque: Pour un système de préparation de tampon détaillée, se reporter au tableau 1.
2. Décongeler le culot de cellules de la culture d'un litre neuf et dissoudre dans 150 ml de PBS à 4 ° C. Sonication de la suspension cellulaire à trois reprises pendant 2 minutes (puissance 130 W, amplitude de 20%, la fréquence d'impulsion de 50%) pour rompre les cellules. Gardez la suspension de cellules sur la glace pendant la sonication.
3. centrifuge de la suspension cellulaire traitée par ultrasons (43667 x g, 30 min, 4 ° C) pour séparer les débris cellulaires du surnageant contenant des protéines exprimées. Recueillir le surnageant et jeter le culot.
4. Lavage et équilibrer 10 ml (= 1 volume de colonne [CV]) suspension de nickel (Ni) des billes d'agarose NTA avec 10 mM de tampon d'imidazole dans une colonne de chromatographie. Ajouter les billes de Ni équilibrée au surnageant de l'étape 3.3 contenant exprimé MBP-His-P domaine de protéine de fusion et laisser incuber pendant 30 min à 4 ° C avec une rotation lente.
5. Après incubation, on applique le mélange de Ni-billes de protéine entière dans une colonne de chromatographie. Laver la colonne lentement avec chaque 5 CV de 10 mM, 20 mM et 50 mM de tampon d'imidazole, à partir de 10 mM, puis 20 mM et 50 mM dernier (figure 3A).
6. Éluer la protéine MBP-protéine His-P domaine de fusion en utilisant 250 mM de tampon d'imidazole (figure 3A). Pendant l' élution, vérifier le _280nm de diamètre extérieur pour vérifier l'élution de la protéine de fusion (la montée en DO ₂₈0nm). Poursuivre l' élution jusqu'à ce que la DO _{280 nm} de chute à ~ 0,1. Laver les billes avec des quantités excessives de 250 mM de tampon d'imidazole (au moins 10 CV), suivie d'au moins 10 CV de 10 mM de tampon d'imidazole. Enregistrez les perles pour la deuxième étape de purification (section 4).
7. Vérifier la présence du domaine MBP-His-P protéine de fusion par SDS-PAGE en utilisant un gel 12% de polyacrylamide-SDS (10 x 8 cm) ⁹ (figure 3A). Effectuer une électrophorèse sur gel à 45 A et 200 V pendant 45 min.
8. Concentré (par exemple, en utilisant un concentrateur commercial) dans le domaine MBP-His-P protéine de fusion éluée à une concentration finale de ~ 3 mg / ml. Cliver le domaine MBP-His-P fusion avec HRV-protéase 3C pendant la dialyse contre 2 litres de tampon 10 mM imidazole (~ 1: 100) pendant une nuit à 4 ° C (figure 3A). En fonction du volume final de protéine concentrée, effectuer une dialyse dans une cassette de dialyse ou d'un tube de dialyse.
   Note: La quantité de HRV-3C protease pour la protéineclivage est calculée en fonction de l'activité spécifique de protéase (2 U / pl, 1 U est suffisant pour cliver 100 ug de protéine) et la quantité de élué protéine de fusion qui varie selon le niveau d'expression et peut être estimée à partir des résultats de SDS-PAGE (3,7 ).

4. 2 ^ème étape de purification

1. Equilibrer les Ni-billes de l'étape 3.6 dans un tampon imidazole 10 mM.
2. Incuber la protéine dialysée provenant de l'étape 3.7 (contenant le domaine clivée P, la protéine MBP et HRV-protéase) avec les billes de Ni (4.1) équilibrée pendant 30 min à 4 ° C avec une rotation lente.
3. Appliquer le mélange de Ni-perles dans une colonne et recueillir le flux continu (domaine clivée P) (figure 3B). Mesurer la concentration de la protéine telle qu'elle se détache de la colonne jusqu'à ce que la DO _{280 nm} atteint de ~ 0,1.
   Note: La MACM-His devrait rester lié aux Ni-billes (figure 3B).
4. Vérifier la présence de P clivée domaine en utilisant SDS-PAGE avec un 1Gel à 2% , comme décrit ci - dessus (figure 3B). On concentre le domaine P élue à ~ 3 mg / ml et on dialyse pendant une nuit à 4 ° C contre GFB SEC pour la purification ultérieure.

5. 3 ^ème étape de purification

1. Les pompes de lavage et les tuyaux du système de purification par HPLC et pré-équilibrer la SEC colonne (voir la liste des matériaux) avec GFB.
2. Injecter le domaine P de la colonne à un débit de 1 ml / min en utilisant un superliaison (jusqu'à 12 ml) ou de la boucle (jusqu'à 3 ml), en fonction du volume de l'échantillon concentré. Après l'injection est terminée, d'augmenter le débit à 2,5 ml / min.
3. Comme le diamètre extérieur augmente et le domaine P provient de la colonne, la collecte des fractions de 1,5 ml. Vérifiez les fractions en utilisant SDS-PAGE avec un gel à 12% (figure 4A et 4B). Piscine seulement les fractions les plus pures et se concentrer pour ~ 3 mg / ml et ~ 8 mg / ml.
   Remarque: Après ~ 110 ml (volume vide) la plupart des impuretés sont éluées d'une colonne SEC avec un volume de 320 ml de lit. leP domaine est habituellement élue comme un dimère. Le temps d'élution / volume du dimère de domaine P dépend de la qualité de préparation (p) de la colonne SEC.

6. La cristallisation du P Domaine

1. Utilisez le domaine P à ~ 3 mg / ml et 8 mg / ml pour le criblage de cristallisation initiale. Préparer au moins 100 pi de P domaine par concentration pour les écrans initiaux avec 384 conditions de dépistage disponibles dans le commerce. Effectuer le dépistage à 18 ° C dans un format de plaque à 96 puits où le réservoir contient 100 ul de solution mère et une goutte est composée de solution mère 0,2 et 0,2 ul de protéine pi.
2. Répéter et optimiser les conditions de cristallisation réussies. Par conséquent, utiliser des plaques 15 puits contenant 3 rangs. Mettre en place la première ligne avec une solution mère à 100%, la deuxième rangée avec une solution de 90% de la mère et de 10% d'eau, et la troisième rangée avec une solution mère de 80% et 20% d'eau. Utilisez une taille de goutte de 2 pi (solution de protéine + 1 pl de mère 1 pi) et 50081; L de la solution mère en tant que volume de réservoir.
3. Utiliser des conditions de cristal optimisées pour co-cristallisant le domaine de P avec des ligands. Préparer les plaques comme décrit dans 6.2. Au lieu de 2 ul de la taille des gouttelettes, mise en place des gouttes contenant une solution mère ul, 1 ul de protéine, et 1 ul d'un ligand à une concentration de 1 mg / ml.
4. Recueillir des ensembles de données de monocristaux en utilisant le rayonnement synchrotron. Effectuer le remplacement moléculaire en utilisant des structures P de domaine publiés avec une similarité de séquence élevée initiale ^6,10-13 modèle de recherche.
   Remarque: La présence d'un ligand apparaît comme blob non modélisé de la densité électronique.

Résultats

Le schéma du protocole décrit est représenté sur la figure 1. Le protocole comprend 6 parties principales qui comprennent le clonage du gène cible, l' expression d' une purification en trois étapes, et la cristallisation. La figure 2 illustre la conception de la construction d'expression (CE) , et caractéristiques du vecteur d'expression pMalc2x. La séquence du site de clonage multiple (MCS) du vecteur pMalc2x montre restriction e...

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole pour l'expression et la purification de P domaines de norovirus en haute qualité et la quantité. Les norovirus sont pas bien étudiés et les données structurelles sont continuellement nécessaires. À notre connaissance, la production de domaine P en utilisant d' autres protocoles (par exemple, P domaines de la TPS-étiqueté) a été problématique, à ce jour, et les données structurelles suffisantes sur l' interaction norovirus-hôte ont été portées dispa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products