Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in<em&gt; E. coli</em&gt; Per la cristallografia a raggi X

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo per esprimere e purificare norovirus di alta qualità sporgenti (P) domini in E. coli per l'utilizzo in studi di cristallografia a raggi X. Questo metodo può essere applicato ad altri domini calicivirus P, così come le proteine ​​non-strutturali, cioè., Proteina virale genoma-linked (VPG), proteasi, e RNA RNA dipendente polimerasi (RdRp).

Abstract

Il capside norovirus è composto da una singola proteina strutturale principale, denominato VP1. VP1 è suddiviso in un guscio (S) dominio e un dominio sporgenti (P). Il dominio S forma una impalcatura contigua intorno l'RNA virale, mentre le forme di dominio P picchi virali sul dominio S e contiene determinanti per antigenicità e host-cellule interazioni. Il dominio P lega strutture di carboidrati, ad esempio., Antigeni del gruppo isto-sangue, che si pensa siano importanti per le infezioni norovirus. In questo protocollo, si descrive un metodo per la produzione di domini norovirus P di alta qualità con rese elevate. Queste proteine ​​possono quindi essere utilizzati per la cristallografia a raggi X ed ELISA per studiare antigenicità e host-cellule interazioni.

Il dominio P viene prima clonato in un vettore di espressione e quindi espressa in batteri. La proteina è purificata utilizzando tre fasi che coinvolgono immobilizzati metallo-ioni cromatografia di affinità e le dimensioni cromatografia di esclusione. Inlinea di principio, è possibile clonare, espresso, purificare, e cristallizzare le proteine ​​in meno di quattro settimane, il che rende questo protocollo un sistema rapido per l'analisi dei ceppi di norovirus emergenti.

Introduzione

Norovirus umani sono la principale causa di gastroenterite acuta in tutto il mondo ^1. Questi virus appartengono alla famiglia Caliciviridae, di cui ci sono almeno cinque generi, tra cui Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, e Nebovirus. Nonostante il loro elevato impatto sul sistema sanitario e ampia distribuzione, lo studio dei norovirus umani è ostacolata dalla mancanza di un sistema di coltura cellulare robusto. Fino ad oggi, non ci sono vaccini autorizzati o strategie antivirali disponibili.

La proteina capside maggiore norovirus, definito VP1, può essere diviso in un guscio (S) e un dominio sporgente (P) del dominio ^2. Il dominio P è collegato al dominio S da una regione cerniera flessibile (H). Il dominio S forma una impalcatura attorno alla RNA virale, mentre il dominio P costituisce la parte più esterno del capside virale. Il dominio P assembla in dimeri biologicamente rilevanti quando espresso in batteri. Il P dIMER interagisce con le strutture di carboidrati, denominati antigeni del gruppo isto-sangue (HBGAs) che sono presenti come antigeni solubili nella saliva e trovato su alcune cellule ospiti ^3. L'interazione dominio HBGA P è pensato per essere importante per l'infezione ^4. Infatti, un recente rapporto ha rivelato l'importanza di HBGAs sintetici o HBGA esprimono batteri per l'infezione da norovirus umano in vitro ^5.

Gli studi in corso per quanto riguarda l'attaccamento cellula ospite di norovirus sono principalmente eseguiti con particelle virus-simili (VLP) che possono essere espresse in cellule di insetto o con i domini P ricombinanti espressi in Escherichia coli (E. coli). Per capire le interazioni P dominio HBGA a risoluzione atomica, strutture complesse P dominio HBGA possono essere risolti mediante cristallografia a raggi X. Qui, descriviamo un protocollo per l'espressione del dominio P e purificazione che permette la produzione di dominio P in alta quantità e qualità da utilizzare per crystall raggi Xografia. Inoltre, questo metodo può essere applicato per altri domini calicivirus P e proteine ​​non strutturali.

Il dominio P è codone-ottimizzato per E. espressione coli e clonato in un vettore di trasferimento standard. Il dominio P viene poi ri-clonato in un vettore di espressione che codifica una polyhistidine tag (His) e una proteina legante mannosio (MBP) che sono seguiti da un sito proteasi clivaggio. Il-His-P MBP proteina di fusione del dominio è espresso in E. coli, seguita da tre fasi di purificazione. La proteina di fusione del dominio MBP-His-P viene purificato mediante cromatografia immobilizzato metallo ionica affinità (IMAC). Successivamente, la proteina di fusione viene scisso con rinovirus umano (HRV) proteasi -3C e il dominio P è separato dal MBP-His da un ulteriore passaggio di purificazione IMAC. Infine, il dominio P viene purificato mediante cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Il dominio P purificato può essere utilizzato per la cristallografia a raggi X. Proiezione delle condizioni di cristallizzazione delle proteine ​​è perfoconfermate con i kit di screening disponibili in commercio che utilizzano differenti concentrazioni di proteine ​​dominio P. crescita dei cristalli si osserva e le condizioni più promettenti sono ottimizzate.

Con i metodi qui descritti, è possibile passare dal gene alla proteina di strutturare in meno di quattro settimane. Pertanto, il nostro metodo di espressione P dominio, purificazione e cristallizzazione è adatto per studiare l'interazione norovirus-ospite a livello molecolare e di fornire dati importanti per aiutare nella progettazione e farmaci di screening vaccino up-to-date.

Protocollo

1. P dominio Clonazione

1. Determinare la regione codificante dominio P per l'allineamento di sequenze di ceppi di norovirus (ad esempio, ceppo GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) ^6. Inoltre, rimuovere la regione flessibile all'estremità C-terminale del dominio P (Figura 2A). Codone-ottimizzare il DNA per E. espressione coli e comprendono BamHI (N-terminale) e NotI (C-terminale) siti di restrizione al fine di sub-clone del dominio P regione codificante in pMalc2x vettore di espressione ^6,7.
   Nota: La regione codificante dominio P è ottimizzata e sintetizzato da un servizio commerciale. Il dominio P regione codificante (inserto) è di circa 1 kb di lunghezza e consegnato in un vettore di trasferimento standard.
2. Digest 2 ug del vettore di trasferimento con ogni 1 BamHI microlitri (20.000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) enzimi di restrizione per 1 ora a 37 ° C con il produttore fornito buffer.
3. Separare l'inserto digerito su un gel di agarosio 1%per 20 min a 135 V e purificare il DNA dell'inserto dal gel usando un kit commerciale.
4. Preparare il vettore di espressione pMalc2x digerendo 2 ug di questo vettore con ciascuna 1 ml BamHI (20.000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) enzimi di restrizione per 1 ora a 37 ° C. Purificare il vettore da un gel di agarosio come descritto sopra (1.3). Nota: Entrambi i campioni (1.2 e 1.4) possono essere conservati a -20 ° C.
5. Legare l'inserto purificato nel vettore pMalc2x digerito nei siti di restrizione BamHI e NotI con 1 ml T4-DNA ligasi (400.000 U / ml) per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) (Figura 2B e 2C). Utilizzare almeno 20 ng del vettore pMalc2x e un vettore: rapporto inserto 1: 3 (peso molecolare). La miscela di legamento è di solito ~ 20 l.
6. Transform 2 ul di miscela di ligasi in E. 50 microlitri chimicamente competenti coli DH5α cellule batteriche utilizzando un protocollo standard di trasformazione (10 min in ghiaccio, heat shock 45 sec a 42 ° C) e crescere in 600media SOC ml per 1 ora a 37 ° C. Centrifugare le cellule trasformate per 3 minuti a 1000 xg, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 30 ml di mezzo SOC.
   1. Piatto mix trasformazione su piastre LB-Agar, contenente 100 ug / ml di ampicillina per la selezione, e crescere durante la notte a 37 ° C. Selezionare almeno cinque colonie.
7. Per ciascuna delle cinque colonie, inoculare 2-3 coltura ml di LB-medium supplementato con 50 ug / ml di ampicillina (LB-amp) e crescere agitando per una notte a 160 rpm a 37 ° C.
8. Estrarre i plasmidi dalla cultura durante la notte utilizzando un kit commerciale. Verificare la presenza dell'inserto dominio P mediante sequenziamento con un primer forward pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') e primer reverse (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

Espressione 2. P Domain

1. Trasforma 1 ml (150 ng / ml - 400 ng / ml) della codifica vettore pMalc2x per il MBP-His-P dominioproteina di fusione in 50 ml di E. competente cellule coli BL21 utilizzando un protocollo standard di trasformazione (10 min in ghiaccio, heat shock 45 sec a 42 ° C) e crescono in media SOC 600 ml per 1 ora a 37 ° C. Subculture in 120 ml di LB-amp durante la notte a 160 giri al minuto e 37 ° C.
2. Seminare nove litri (ad esempio, 6 x 5 L palloni con 1,5 L di medie ciascuna) di LB-amp con la sottocultura (1: 100). Crescere le cellule agitando a 160 giri al minuto e 37 ° C fino a quando la OD ₆₀₀ raggiunge 0,4-0,6. Successivamente, abbassare la temperatura a 22 ° C per ~ 1 ora e quindi indurre l'espressione di proteine ​​con 0,66 mM di isopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ^8. Crescere le cellule durante la notte a 22 ° C (~ 18 ore).
   Nota: La temperatura può essere variata, ma si consiglia di utilizzare 22 ° C o inferiore.
3. Raccogliere le cellule per centrifugazione (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Eliminare il surnatante e congelare il pellet cellulare a -20 ° C.

3. 1 ^° Purificazione Step e proteasi fenditura

1. Preparare buffer che vengono utilizzati durante le fasi di purificazione proteine ​​da soluzioni madre di garantire riproducibilità e stabilità degli esperimenti. Preparare quattro tamponi differenti per il metallo immobilizzato ionico cromatografia di affinità (IMAC), ciascuno contenente una diversa concentrazione di imidazolo (10 mM, 20 mM, 50 mM e 250 mM). Per la SEC, preparare un tampone di gel-filtrazione (GFB) con una concentrazione di sale più elevata, ma senza imidazolo. Utilizzare acqua deionizzata e filtrare tutti i buffer prima di utilizzarlo con una dimensione dei pori di 0,45 micron.
   Nota: Per una dettagliata schema di preparazione del buffer, fare riferimento alla Tabella 1.
2. Scongelare il pellet di cellule dalla cultura nine litri e sciogliere in 150 ml di PBS a 4 ° C. Sonicare la sospensione cellulare tre volte per 2 min (potenza 130 W, ampiezza 20%, frequenza impulsi 50%) per distruggere le cellule. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio durante sonicazione.
3. Centrifuge la sospensione cellulare sonicato (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) per separare detriti cellulari dal supernatante contenente proteina espressa. Raccogliere il surnatante e scartare il pellet.
4. Lavare ed equilibrare 10 ml (= 1 volume colonna [CV]) impasto di Nichel (Ni) perline agarosio -nta con 10 mM tampone imidazolo in una colonna cromatografia. Aggiungere le perline Ni equilibrati per il surnatante dal punto 3.3 contenente espresso MBP-His-P dominio proteina di fusione e incubare per 30 minuti a 4 ° C con rotazione lenta.
5. Dopo l'incubazione, applicare l'intera miscela Ni-bead-proteina ad una colonna cromatografica. Lavare la colonna lentamente con ogni 5 CV di 10 mm, 20 mm, e 50 mm buffer imidazolo, a partire da 10 mm, 20 mm e poi le 50 mm (Figura 3A).
6. Eluire il MBP-His-P proteina di fusione del dominio utilizzando 250 mm tampone imidazolo (Figura 3A). Durante l'eluizione, controlla _l'280nm OD per verificare l'eluizione della proteina di fusione (l'aumento OD ₂₈0nm). Continuare fino a quando la eluizione _280nm OD scende a ~ 0.1. Lavare le perline con quantità eccessive di 250 mm tampone imidazolo (almeno 10 CV), seguita da almeno 10 CV di 10 mm tampone imidazolo. Salvare le perline per la seconda fase di purificazione (sezione 4).
7. Verificare la presenza della proteina di fusione del dominio MBP-His-P con SDS-PAGE su gel 12% SDS-poliacrilammide (10 x 8 cm) ⁹ (Figura 3A). Eseguire gel elettroforesi a 45 A e 200 V per 45 min.
8. Concentrato (ad esempio, utilizzando un concentratore commerciale) dominio MBP-His-P proteina di fusione eluita ad una concentrazione finale di ~ 3 mg / ml. Cleave la fusione del dominio MBP-His-P con HRV-3C proteasi durante la dialisi contro 2 L di 10 mM di tampone imidazolo (~ 1: 100) notte a 4 ° C (Figura 3A). A seconda del volume finale di proteine ​​concentrate, eseguire la dialisi in una cassetta dialisi o tubo di dialisi.
   Nota: La quantità di HRV-3C proteasi per le proteineclivaggio viene calcolato secondo la specifica attività della proteasi (2 U / ml, 1 U è sufficiente per fendere 100 mg di proteina) e la quantità di proteina di fusione eluite che varia il livello di espressione e può essere stimata dal risultato SDS-PAGE (3.7 ).

4. 2 ^° Fase Purificazione

1. Equilibrare le Ni-perle dal punto 3.6 a 10 tampone imidazolo mm.
2. Incubare la proteina dializzata dal punto 3.7 (contenente dominio spaccati P, proteine ​​MBP e HRV-proteasi) con le Ni-perle equilibrate (4.1) per 30 minuti a 4 ° C con rotazione lenta.
3. Applicare la miscela Ni-bead a una colonna e raccogliere il flow-through (dominio P spaccati) (Figura 3B). Misurare la concentrazione di proteine ​​come viene fuori la colonna fino alla _280nm OD raggiunge ~ 0.1.
   Nota: Il MBP-His dovrebbe rimanere legato alle Ni-perline (figura 3b).
4. Verificare la presenza di dominio spaccati P mediante SDS-PAGE con un 1Gel 2% come sopra descritto (Figura 3B). Concentrare il dominio P eluita a ~ 3 mg / ml e dializzare notte a 4 ° C contro GFB per successiva purificazione SEC.

5. 3 ^° Purificazione Passo

1. Le pompe di lavaggio e tubi del sistema di purificazione HPLC e pre-equilibrare la SEC-colonna (vedi elenco Materials) con GFB.
2. Iniettare il dominio P per la colonna ad una portata di 1 ml / min usando un Superloop (fino a 12 ml) o loop (fino a 3 ml), a seconda del volume del campione concentrato. Dopo l'iniezione è terminata, aumentare la portata di 2,5 ml / min.
3. Come le OD aumenta e il dominio P si stacca la colonna, raccogliere frazioni di 1,5 ml. Controllare frazioni utilizzando SDS-PAGE con un gel al 12% (Figura 4A e 4B). Pool solo i più puri frazioni e concentrarsi per ~ 3 mg / ml e ~ 8 mg / ml.
   Nota: dopo ~ 110 ml (volume vuoto) la maggior parte delle impurità vengono eluite da una colonna SEC con un volume di 320 ml letto. Ildominio P è generalmente eluito come dimero. Elution tempo / volume del dimero dominio P dipende dal grado di preparazione (pg) della colonna SEC.

6. Cristallizzazione della P Domain

1. Utilizzare il dominio P a ~ 3 mg / ml e 8 mg / ml per lo screening cristallizzazione iniziale. Preparare almeno 100 ml di dominio P per la concentrazione per gli schermi iniziali con 384 condizioni di screening disponibili in commercio. Eseguire lo screening a 18 ° C in un formato piastra a 96 pozzetti, dove il serbatoio contiene 100 ml di soluzione madre e una goccia è composta da 0,2 soluzione madre microlitri e 0,2 microlitri proteina.
2. Ripetere e ottimizzare le condizioni di cristallizzazione di successo. Pertanto, utilizzare piastre 15 pozzetti contenenti 3 righe. Impostare la prima fila con soluzione madre 100%, la seconda fila con soluzione al 90% madre e 10% di acqua, e la terza fila con soluzione madre 80% e 20% di acqua. Utilizzare una dimensione goccia di 2 ml (soluzione madre di proteine ​​+ 1 ml 1 ml) e 50081; l di soluzione madre come volume del serbatoio.
3. Utilizzare le condizioni di cristallo ottimizzate per la co-cristallizzare il dominio P con leganti. Preparare piastre come descritto al punto 6.2. Invece di 2 microlitri dimensioni di goccia, impostare gocce contenenti 1 ml soluzione madre, 1 proteine ​​ml e 1 ml di ligando ad una concentrazione di 1 mg / ml.
4. Raccogliere set di dati di singoli cristalli utilizzando radiazione di sincrotrone. Eseguire la sostituzione molecolare utilizzando strutture di dominio P pubblicati con una somiglianza alta sequenza iniziale di ricerca del modello ^6,10-13.
   Nota: La presenza di un ligando si presenta come non-modellato blob di densità elettronica.

Risultati

Lo schema del protocollo descritto è illustrato in Figura 1. Il protocollo comprende 6 parti principali che includono la clonazione del gene bersaglio, espressione, una purificazione tre fasi, e la cristallizzazione. Figura 2 illustra il disegno del costrutto di espressione (CE) e caratteristiche del vettore di espressione pMalc2x. La sequenza del sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore pMalc2x mostra restrizione e proteasi siti di taglio. ...

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo per l'espressione e la purificazione di domini P norovirus in alta qualità e quantità. Norovirus non sono ben studiati e dati strutturali sono continuamente necessari. A nostra conoscenza, la produzione dominio P utilizzando altri protocolli (ad esempio, domini P GST-tagged) è stato problematico, fino ad ora, e dati strutturali sufficienti interazione norovirus-host sono stati dispersi. Con il metodo qui descritto, abbiamo recentemente contribuito in modo significativo alla...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products