ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で<em&gt; E。大腸菌</em&gt; X線結晶用

要約

ここでは、Eに（P）ドメインを突出高品質のノロウイルスを発現し、精製するための方法を記載しますX線結晶学研究における使用のための大腸菌 。この方法は、他のカリシウイルスPドメイン、ならびに非構造タンパク質に適用することができる、すなわち 、ウイルスタンパク質ゲノム結合（のVPg）、プロテアーゼ、及びRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）。

要約

ノロウイルスキャプシドは、単一の主要構造タンパク質で構成され、VP1と呼ばれます。 VP1は、シェル（S）ドメインと突起（P）ドメインに細分されます。 Sドメインは、PドメインのフォームSドメイン上のウイルスのスパイクのに対し、ウイルスRNAの周りに連続した足場を形成し、抗原性および宿主細胞の相互作用のための決定が含まれています。 Pドメインは、炭水化物構造、 すなわち特異的に結合する。ノロウイルス感染症のために重要であると考えられている、ヒスト血液型抗原、。このプロトコルでは、我々は、高収率で高品質のノロウイルスPドメインの製造方法を説明します。これらのタンパク質は、次いで抗原と宿主細胞の相互作用を研究するために、X線結晶構造解析およびELISAのために使用することができます。

Pドメインは、まず、発現ベクターにクローニングした後、細菌中で発現されます。タンパク質は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ​​排除クロマトグラフィーを固定化することを含む3つのステップを使用して精製されます。に原理は、特急、クローン精製し、そしてこのプロトコル新興ノロウイルス株を分析するための迅速なシステムになり4週間未満、中のタンパク質を結晶化することが可能です。

概要

人間のノロウイルスは、急性胃腸炎、世界中の¹の主な原因です。これらのウイルスはノロウイルス 、 サポウイルス 、Lagovirus、 ベシウイルス 、およびNebovirusを含む少なくとも5属が存在するうち、 カリシウイルス科ファミリーに属します。医療システムと広く分布に対するそれらの高い衝撃にもかかわらず、人間のノロウイルスの研究は、強固な細胞培養系の欠如によって妨げられています。現在までに、利用可能な認可されたワクチンまたは抗ウイルス戦略はありません。

ノロウイルスの主要キャプシドタンパク質、VP1と呼ばれるシェル（S）ドメインと突起（P）領域²に分割することができます。 Pドメインは、柔軟なヒンジ（H）領域によってSドメインに接続されています。 Pドメインは、ウイルスキャプシドの最も外側の部分を形成するのに対し、Sドメインは、ウイルスRNAの周りに足場を形成します。細菌で発現された場合、Pドメインは、生物学的に関連する二量体に組み立てます。 P DIMERは、糖鎖構造と相互作用し、唾液中の可溶性抗原として存在し、特定の宿主細胞³に見られるヒスト血液型抗原（HBGAs）と呼ばれます。 PドメインHBGA相互作用は、感染⁴のために重要であると考えられています。確かに、最近の報告では、in vitro ⁵ でのヒトノロウイルス感染症のための合成HBGAsまたはHBGA-発現する細菌の重要性を明らかにしました。

ノロウイルスの宿主細胞付着に関する現在の研究は、主に、昆虫細胞または大腸菌 （E. coli）中で発現される組換えPドメインと表現することができるウイルス様粒子（VLP）を用いて行われます。原子分解能でPドメインHBGA相互作用を理解するために、PドメインHBGA複雑な構造は、X線結晶学を用いて解くことができます。ここでは、高い量と質のPドメインの生産はX線クリに使用されることを可能にするPドメインの発現および精製のためのプロトコルを記述しography。また、この方法は、他のカリシウイルスのPドメインおよび非構造タンパク質に適用することができます。

Pドメインは、 大腸菌のためにコドン最適化され大腸菌発現標準トランスファーベクターにクローニングしました。 Pドメインは、その後プロテアーゼ切断部位が続くポリヒスチジン（His）をタグ及びマンノース結合タンパク質（MBP）をコードする発現ベクターに再クローニングします。 MBP-Hisを、Pドメインの融合タンパク質は、 大腸菌で発現されます大腸菌は 、3精製工程が続きます。 MBP-Hisを-Pドメイン融合タンパク質は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）を用いて精製されます。次に、融合タンパク質は、ヒトライノウイルス（HRV）-3℃プロテアーゼ及びPドメインが追加のIMAC精製工程によってMBP-彼から分離されて切断されます。最後に、Pドメインは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて精製されます。精製されたP領域は、次に、X線結晶学のために使用することができます。タンパク質結晶化条件のスクリーニングはperfoです異なるPドメインタンパク質の濃度を用いて、市販のスクリーニングキットにrmed。結晶成長が観察され、最も有望な条件が最適化されています。

ここに記載された方法で、それ未満で4週間以内に構築するタンパク質を遺伝子から移動することが可能です。したがって、Pドメインの発現、精製、および結晶化の手法は、分子レベルでノロウイルス - 宿主相互作用を研究し、最新のワクチン設計および薬物スクリーニングを支援するために重要なデータを提供するのに適しています。

プロトコル

1. Pドメインのクローニング

1. ノロウイルス株の配列アラインメントによってPドメインコード領域を決定する（例えば、GII.10株、GenBankの^{：AF504671、PDB-ID：3ONU）6。}また、Pドメイン（ 図2A）のC末端にフレキシブル領域を削除します。 E.のためのDNAを、コドン最適化大腸菌発現とサブクローンPドメインはpMalc2xについての発現ベクター^6,7にコード領域への順序でのBamHI（N末端 ​​）およびNotI（C末端）制限部位を含みます。
   注：Pドメインコード領域を最適化し、商業サービスによって合成されます。地域（挿入）をコードPドメインは、長さが約1キロバイトと標準トランスファーベクターで配信します。
2. メーカーに37℃で1時間のために各1μLのBamHI（2万U / ml）およびNotIで（10,000 U / ml）を制限酵素でトランスファーベクター2μgのダイジェストは、バッファを供給する。
3. 1％アガロースゲル上で消化し、インサートを分離135 Vで20分間、および市販のキットを用いてゲルからの挿入DNAを精製します。
4. 各1μlのをBamHI（2万U / ml）で、このベクター2μgのを消化することによってpMalc2xについて発現ベクターを準備およびNotI（10,000 U / ml）の制限は、37℃で1時間酵素。 （1.3）上記のようにアガロースゲルからベクターを精製します。注：両方のサンプル（1.2および1.4）は-20℃で保存することができます。
5. 室温（RT）（ 図2Bおよび2C）で15分間、1μlのT4-DNAリガーゼ（40万U / ml）でのBamHIおよびNotI制限部位で消化pMalc2xについてベクターに精製された挿入物を連結。インサート比1：3（分子量）pMalc2xについてベクトルとベクトルの少なくとも20 ngのを使用してください。連結混合物は、通常〜20μlです。
6. 50μlの化学的コンピテントE.にライゲーションミックスの2μLを変換します（42°Cで氷上で10分間、熱ショック45秒）標準的な形質転換プロトコルを用いて大腸菌 DH5α細菌細胞および600で成長37℃で1時間μlのSOC培地。遠心分離機は、形質転換された細胞は、千×gで3分間、上清を廃棄し、SOC培地30μlにペレットを再懸濁します。
   1. 選択のために100μg/ mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート上に形質転換混合物をプレーティングし、37℃で一晩成長します。少なくとも5つのコロニーを選択します。
7. 5個のコロニーのそれぞれについて、50μg/ mlのアンピシリン（LB-アンペア）を補充したLB培地2〜3mlの文化を接種し、37℃で160 rpmで一晩振とうすることにより成長します。
8. 市販のキットを用いて、一晩培養液からプラスミドを抽出します。 pMalc2xについてフォワードプライマー（5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 '）と配列決定によるPドメインインサートの存在を確認し、逆方向プライマー（5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3'）。

2. Pドメイン式

1. MBP-Hisを-PドメインのpMalc2xについてベクトル符号化の - （400 ngの/μlの150 ngの/μl）を1μLを変換しますコンピテントE.の50μlの中に融合タンパク質標準的な形質転換プロトコル（氷上で10分間、熱ショックを42℃で45秒）を用いて大腸菌 BL21細胞と37℃で1時間、600μlのSOC培地中で増殖します。 160 rpmで37℃で一晩LB-アンペアの120ミリリットル中にサブカルチャー。
2. サブカルチャー（1：100）を含むLB-アンペアの9リットル（ 例えば、1.5 L培地それぞれに6×5 Lフラスコ）を接種します。 0.6 - OD _600が 0.4に達するまで、160 rpmで、37℃で振とう細胞を増殖させます。その後、約1時間22℃に温度を下げ、その後、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドの0.66ミリモル^（IPTG）8でタンパク質発現を誘導します。一晩22℃（〜18時間）で細胞を成長させます。
   温度を変化させることができるが、我々は22℃以下を使用することをお勧めします。注意して​​ください。
3. 遠心分離によって細胞を採取（10543×gで、15分間、4℃）。上清を捨て、-20℃で細胞ペレットを凍結します。

3。 1 ^回目の精製工程およびプロテアーゼ切断

1. 実験の再現性と安定性を保証するためにストック溶液からのタンパク質の精製工程中に使用されるバッファを準備します。固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）、各イミダゾールの異なる濃度で含む（10ミリメートル、20ミリメートル、50ミリメートル、250 mM）のための4つの異なる緩衝液を調製します。 SECのために、より高い塩濃度でゲルろ​​過バッファー（GFB）を調製するが、イミダゾールなし。すべてのバッファ孔径0.45μmの使用前に脱イオン水とフィルターを使用してください。
   注：詳細なバッファ準備制度については、 表1を参照してください。
2. 9個のリットルの培養物からの細胞ペレットを解凍し、4℃で150 mlのPBSに溶解します。細胞を破壊し、細胞懸濁液を2分間​​、三回（電源130 W、振幅20％、パルス周波数、50％）を超音波処理。超音波処理中氷上の細胞懸濁液を保管してください。
3. CentrifuGE発現タンパク質を含有する上清から細胞残屑を分離するために超音波処理した細胞懸濁液（43667×gで、30分間、4℃）。上清を収集し、ペレットを捨てます。
4. 洗浄およびニッケル（Ni）のクロマトグラフィーカラム中の10mMイミダゾール緩衝液で-NTAアガロースビーズの10ミリリットル（= 1カラム容量[CV]）スラリーを平衡化。発現されたMBP-Hisを-Pドメイン融合タンパク質を含む、ステップ3.3からの上清を平衡化したNiビーズを追加し、ゆっくり回転させながら4℃で30分間インキュベートします。
5. インキュベーションの後、クロマトグラフィーカラムに全体のNi-ビーズ - タンパク質混合物を適用します。 10 mMの後、20 mMのと最後の50mM（ 図3A）から開始し、10 mMの、20 mMの、および50mMのイミダゾール緩衝液の各5 CVのでゆっくりとカラムを洗浄。
6. 250mMイミダゾール緩衝液（ 図3A）を用いてMBP-Hisを-Pドメイン融合タンパク質を溶出させます。溶出の間、融合タンパク質の溶出（OD ₂₈の上昇を確認するために、ODを_280nmのを確認します0nm）。 ODを_280nmのは 〜0.1に低下するまで、溶出を続けます。 10mMのイミダゾール緩衝液の少なくとも10のCVが続く250mMのイミダゾールバッファー（少なくとも10のCV）、過剰量でビーズを洗浄します。第二の精製工程（セクション4）のためのビーズを保存します。
7. 12％SDSポリアクリルアミドゲル（10×8センチ^）9（ 図3A）を用いてSDS-PAGEでMBP-Hisを-Pドメイン融合タンパク質の存在を確認します。 45 Aでゲル電気泳動を行い、45分間200 V。
8. 〜3ミリグラム/ mlの最終濃度に濃縮する（ 例えば、商業的コンセントレータを使用して）溶出MBP-Hisを、Pドメインの融合タンパク質。 4°C（ 図3A）で一晩：（100〜1）10mMのイミダゾール緩衝液の2リットルに対して透析中のHRV-3CプロテアーゼとMBP-彼-Pドメイン融合を切断。濃縮されたタンパク質の最終容量に応じて、透析カセットまたは透析チューブで透析を行います。
   注：タンパク質のためのHRV-3Cプロテアーゼの量を切断は、特定のプロテアーゼ活性に応じて（2 U /μl、1 Uは、タンパク質の100μgのを切断するのに十分である）を算出して発現レベルに変化し、SDS-PAGEの結果から推定することができる溶出融合タンパク質の量（3.7さ）。

前記第^2の精製工程

1. 10mMイミダゾール緩衝液中のステップ3.6からのNi-ビーズを平衡化します。
2. ゆっくり回転させながら4℃で30分間平衡化したNi-ビーズ（4.1）と（切断されたP領域、MBPタンパク質、およびHRVプロテアーゼを含有する）ステップ3.7からの透析タンパク質をインキュベートします。
3. 列にニッケルビーズ混合物を適用し、フロースルー（切断されたPドメイン）（ 図3B）を収集。 ODを_280nmのが 〜0.1に達するまで、それは列から離れるようにタンパク質の濃度を測定します。
   注：MBP-彼は、Ni-ビーズ（ 図3B）に結合したままでなければなりません。
4. 1でSDS-PAGEを使用して切断されたPドメインの存在を確認します（ 図3B）上記のように、2％ゲル。 〜3 mg / mlでの溶出Pドメインを濃縮し、その後のSEC精製のためGFBに対して4℃で一晩透析します。

5. 3 ^番目の精製工程

1. 洗浄ポンプとHPLC精製システムのパイプとプレ平衡化SEC-列をGFBと（材料リストを参照してください）​​。
2. 濃縮試料の量に応じて、1ミリリットル（3ミリリットルまで）スーパーループ（最大12 ml）またはループを使用して/分の流速でカラムにPドメインを注入します。注入が完了した後、/分で2.5 mlに、流速を増加させます。
3. ODが増加し、Pドメインは列から外れたように、1.5ミリリットルの画分を収集します。 12％ゲルを用いてSDS-PAGEを用いて分画を確認する（ 図4Aおよび4B）。プールのみ最も純粋な画分〜3 mg / mlでと〜8 mg / mlとに集中します。
   注：〜110ミリリットル（空隙容量）した後、ほとんどの不純物が320ミリリットル総容積でSECカラムから溶出されます。ザPドメインは、通常、二量体として溶出します。 Pドメインの二量体の溶出時間/ボリュームは、SECカラムのプレップグレード（PG）に依存しています。

Pドメインの6結晶

1. 初期結晶化スクリーニングのための〜3 mg / mlとし、8 mg / mlででPドメインを使用してください。 384市販のスクリーニング条件との最初の画面のために濃度あたりのPドメインの少なくとも100μLを準備します。リザーバは母溶液100μlを含有する96ウェルプレートフォーマットで、18℃でスクリーニングを行い、液滴は、0.2μlの母液及び0.2μlのタンパク質から構成されています。
2. 繰り返し、成功した結晶化条件を最適化します。したがって、3行が含まれている15ウェルプレートを使用します。 100％の母液、90％の母液と10％の水、及び80％の母液と20％の水で3行目と2行目との最初の行を設定します。 2μlの（1μlのタンパク質+ 1μlの母液）と500の液滴サイズを使用します81;リザーバーボリュームとして母液のリットル。
3. リガンドとPドメインを共結晶化のために最適化された結晶条件を使用してください。 6.2で説明したようにプレートを準備します。代わりに、2μlの液滴サイズの、1μlの母液、1μlのタンパク質、および1mg / mlの濃度のリガンドの1μLを含む液滴を設定します。
4. 放射光を用いた単結晶のデータセットを収集します。最初の検索モデル^6,10-13として高い配列類似性で公開Pドメイン構造を用いて分子置換を実行します。
   注：リガンドの存在は、電子密度の非モデル化されたブロブとして表示されます。

結果

記述されたプロトコルの概略図を図1に示されている。プロトコルは、標的遺伝子のクローニング、発現、三段階精製、および結晶化を含む6つの主要な部分をカバーする。 図2は、発現構築物（EC）の設計を示 ​​し、 pMalc2xについての発現ベクターの特性。 pMalc2xについてベクターの多重クローニング部位（MCS）の配列は、制限酵素およびプ?...

ディスカッション

ここで、我々は高品質と量におけるノロウイルスPドメインの発現および精製のためのプロトコルについて説明します。ノロウイルスは十分に研究されておらず、構造データを連続的に必要とされています。我々の知る限りでは、他のプロトコル（ 例えば 、GSTタグ付きPドメイン）を使用して、Pドメインの生産はこれまでのところ、問題となっており、ノロウイルス-ホスト相互作用に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products