Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em<em&gt; E. coli</em&gt; Para raios-X Cristalografia

Resumo

Aqui, descrevemos um método para expressar e purificar norovirus alta qualidade salientes domínios (P) em E. coli para uso em estudos de cristalografia de raios-X. Este método pode ser aplicado a outros domínios calicivírus P, bem como proteínas não estruturais, isto é., A proteína virai ligada ao genoma (VPg), protease, e polimerase de ARN dependente de ARN (RdRp).

Resumo

A cápside norovírus é composto de uma única proteína estrutural principal, denominado VP1. VP1 é subdividida em um domínio (s) casca e um domínio saliente (P). O domínio S forma um andaime contíguo em torno do ARN virai, ao passo que as formas de domínio P picos virais no domínio S e contém determinantes de antigenicidade e interacções célula-hospedeiro. O domínio P se liga a estruturas de hidratos de carbono, isto é., Antigénios do grupo histo-sangue, que se pensa ser importante para infecções norovírus. Neste protocolo, nós descrevemos um método para a produção de domínios de alta qualidade norovírus P com rendimentos elevados. Estas proteínas podem então ser utilizados para a cristalografia de raios-X e de ELISA, a fim de estudar a antigenicidade e interacções da célula hospedeira.

O domínio P é em primeiro lugar clonado num vector de expressão e, em seguida, expresso em bactérias. A proteína é purificada por meio de três passos que envolvem a cromatografia de afinidade com metal imobilizado de iões e cromatografia de exclusão de tamanho. Dentroprincípio, é possível clonar, expressar, purificar e cristalizar proteínas em menos de quatro semanas, o que torna este protocolo um sistema rápido para analisar linhagens de norovírus emergentes.

Introdução

Noroviruses humanos são a principal causa de gastroenterite aguda em todo o mundo ^1. Estes vírus pertencem à família dos Caliciviridae, dos quais existem, pelo menos, cinco géneros, incluindo Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, e Nebovirus. Apesar de seu alto impacto no sistema de saúde e de ampla distribuição, o estudo de norovírus humanos é dificultada pela falta de um sistema de cultura celular robusto. Até à data, não existem vacinas aprovadas ou estratégias antivirais disponíveis.

A principal proteína da cãpside norovírus, denominado VP1, pode ser dividido em um domínio (s) e um invólucro (P) de domínio protuberante ^2. O domínio P é ligado ao domínio S por uma região charneira flexível (H). O domínio S forma um andaime em torno do ARN viral, enquanto que o domínio P constitui a parte mais externa da cápside viral. O domínio P monta em dímeros biologicamente relevantes quando expressos em bactérias. A P dimer interage com estruturas de carboidratos, denominados antígenos do grupo histo-sangue (HBGAs) que estão presentes como antígenos solúveis na saliva e encontra em determinadas células hospedeiras ^3. A interacção do domínio HBGA-P é pensado para ser importante para a infecção ^4. De fato, um relatório recente revelou a importância de HBGAs sintéticos ou HBGA expressando bactérias para a infecção por norovírus humana in vitro ^5.

Estudos actuais sobre a fixação das células de acolhimento de noroviruses são realizados principalmente com partículas semelhantes a vírus (VLPs) que podem ser expressas em células de insecto ou com domínios P recombinantes expressos em Escherichia coli (E. coli). Para entender as interações domínio de HBGA P em resolução atômica, estruturas complexas P domínio de HBGA pode ser resolvido usando cristalografia de raios-X. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a expressão e purificação do domínio P que permite a produção de P no domínio em elevada quantidade e qualidade para ser utilizado para raios X Crystallography. Além disso, este método pode ser aplicado para outros domínios calicivírus P e proteínas não-estruturais.

O domínio P tem codões optimizados para E. expressão em E. coli e clonados num vector de transferência do padrão. O domínio P é então re-clonado num vector de expressão que codifica uma poli-histidina (His) tag e uma proteína de ligação a manose (MBP), que são seguidos por um local de clivagem de protease. A P-His-MBP da proteína de fusão do domínio é expressa em E. coli, seguida de três passos de purificação. A proteína de fusão do domínio MBP-His-P é purificado utilizando cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado (IMAC). Em seguida, a proteína de fusão é clivada com rinovírus humano (HRV) -3c protease e o domínio P é separada a partir do MBP-His por um passo adicional de purificação IMAC. Finalmente, o domínio P é purificado utilizando cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). O domínio P purificado pode então ser utilizado para a cristalografia de raios-X. Rastreio de condições de cristalização proteína é performada com kits de rastreio comercialmente disponíveis, utilizando concentrações de proteína de domínio P diferentes. crescimento de cristais é observado e as condições mais promissores são otimizados.

Com os métodos aqui descritos, é possível passar do gene para proteína a estrutura dentro de menos de quatro semanas. Portanto, o nosso método de expressão P domínio, purificação e cristalização é adequado para estudar a interação norovirus-host no nível molecular e fornecer dados importantes para auxiliar no up-to-date vacina concepção e drogas rastreio.

Protocolo

1. P Domínio Clonagem

1. Determinar a região de domínio P codificação por alinhamento de sequências de cepas de norovírus (por exemplo, a estirpe GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) ^6. Além do mais, remover a região flexível na extremidade C-terminal do domínio P (Figura 2A). Codon-optimizar o ADN para E. expressão de E. coli e incluem BamHI (C-terminal) os sítios de restrição (N-terminal) e Notl, a fim de sub-clone de P o domínio região codificadora no vector de expressão pMalc2x ^6,7.
   Nota: A região de codificação do domínio P é optimizada e sintetizado por um serviço comercial. O domínio P região codificadora (insert) é de aproximadamente 1 kb de comprimento e entregue em um vector de transferência padrão.
2. Digerir 2 ug do vector de transferência com cada 1 ul BamHI (20000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) as enzimas de restrição durante 1 hora a 37 ° C com o fabricante fornecido tampões.
3. Separa-se a inserção digerido num gel de agarose a 1%durante 20 minutos a 135 V e purificar o ADN de inserção a partir do gel utilizando um kit comercial.
4. Prepara-se o vector de expressão pMalc2x por digestão de 2 ug deste vector com cada 1 ul BamHI (20000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) as enzimas de restrição durante 1 hora a 37 ° C. Purifica-se o vector a partir de um gel de agarose tal como descrito acima (1,3). Nota: Ambas as amostras (1,2 e 1,4) pode ser armazenado a -20 ° C.
5. Ligadura a inserção no vector purificado pMalc2x digerido nos locais de restrição BamHI e NotI com 1 ul de ligase de T4-ADN (400.000 U / mL) durante 15 min à temperatura ambiente (RT) (Figura 2B e 2C). Use pelo menos 20 ng do vector e pMalc2x um vector: inserto proporção de 1: 3 (peso molecular). A mistura de ligação é normalmente ~ 20 ul.
6. Transformar 2 ul da mistura de ligação em E. 50 ul quimicamente competente coli DH5a células bacterianas, utilizando um protocolo de transformação padrão (10 min em gelo, de choque térmico de 45 seg a 42 ° C) e crescer em 600meio SOC uL durante 1 hora a 37 ° C. Centrifugar as células transformadas durante 3 min a 1000 xg, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 30 ul de meio SOC.
   1. Placa da mistura de transformação em placas de LB-agar contendo 100 ug / ml de ampicilina para selecção, e crescer durante a noite a 37 ° C. Escolha pelo menos cinco colônias.
7. Para cada uma das cinco colónias, inocular 2-3 mL de cultura de meio LB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina (LB-amp) e crescer por agitação durante a noite a 160 rpm a 37 ° C.
8. Extrair os plasmídeos a partir da cultura durante a noite utilizando um kit comercial. Verificar a presença da inserção por sequenciação do domínio de P com um iniciador directo pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') e o iniciador reverso (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

Expressão 2. P Domínio

1. Transform 1 ul (150 ng / mL - 400 ng / ul) do vector que codifica para o pMalc2x-His-P domínio MBPproteína de fusão em 50 ul de E. competente coli BL21 células usando um protocolo de transformação padrão (10 min em gelo, de choque térmico de 45 seg a 42 ° C) e crescer em meio SOC 600 uL durante 1 hora a 37 ° C. Subcultura em 120 ml de LB-amp durante a noite a 160 rpm e 37 ° C.
2. Inocular nove litros (por exemplo, 6 x 5 L frascos com 1,5 L de meio de cada) de LB-amp com a subcultura (1: 100). Crescer as células com agitação a 160 rpm e 37 ° C, até a _DO600 atinge 0,4-0,6. Subsequentemente, baixar a temperatura para 22 ° C durante ~ 1 h e em seguida, induzir a expressão da proteína com 0,66 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) ^8. Deixar crescer as células durante a noite a 22 ° C (~ 18 horas).
   Nota: A temperatura pode ser variada, mas recomendamos o uso de 22 ° C ou inferior.
3. Colher as células por centrifugação (10543 xg, 15 min, 4 ° C). Descartar o sobrenadante e congelar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C.

3. ^1º Passo Purificação e Protease Cleavage

1. Prepare tampões que são usados ​​durante os passos de purificação de proteínas a partir de soluções de estoque para garantir a reprodutibilidade e a estabilidade das experiências. Prepare quatro buffers diferentes para a cromatografia de afinidade de iões metálicos imobilizados (IMAC), cada uma contendo uma concentração diferente de imidazolo (10 mM, 20 mM, 50 mM e 250 mM). Para a SEC, preparar um tampão de filtração em gel (GFB) com uma concentração de sal mais elevado, mas sem imidazol. Use água desionizada e filtra-se todos os buffers antes da utilização com um tamanho de poro de 0,45 um.
   Nota: Para um detalhado esquema preparação buffer, consulte a Tabela 1.
2. Descongelar o sedimento de células a partir da cultura nove litros e dissolve-se em 150 ml de PBS a 4 ° C. Sonicar a suspensão de células três vezes durante 2 min (potência 130 W, 20% de amplitude, frequência de impulsos 50%) para romper as células. Manter a suspensão de células em gelo durante a sonicação.
3. CentrifuGE a suspensão de células sonicadas (43667 xg, 30 min, 4 ° C) para separar os resíduos celulares do sobrenadante contendo proteína expressa. Recolher o sobrenadante e descartar o pellet.
4. Lavagem e equilibrar 10 ml (volume da coluna = 1 [CV]) suspensão de níquel (Ni) -NTA agarose com tampão de imidazolo 10 mM em uma coluna de cromatografia. Adicionar os grânulos Ni equilibradas para o sobrenadante do passo 3.3 contendo proteína expressa de fusão do domínio MBP-His-P e incubar durante 30 min a 4 ° C com rotação lenta.
5. Após a incubação, aplicam-se toda a mistura de Ni-bead-proteína a uma coluna de cromatografia. Lava-se a coluna com lentamente cada 5 CV de 10 mM, 20 mM e imidazole 50 mM tampões, começando com 10 mM, em seguida, a 20 mM e passada 50 mM (Figura 3A).
6. Elui-se a proteína de fusão do domínio MBP-His-P usando tampão de imidazole 250 mM (Figura 3A). Durante a eluição, verificar a _280nm OD para verificar a eluição da proteína de fusão (o aumento do OD ₂₈0 nM). Continuar a eluição até _280nm OD cai para ~ 0,1. Lavam-se as esferas com quantidades excessivas de tampão de imidazole 250 mM (pelo menos 10 CV), seguido por, pelo menos, 10 CV de 10 mM de tampão de imidazol. Salve as contas para a segunda etapa de purificação (secção 4).
7. Verificar a presença da proteína de fusão do domínio MBP-His-P com SDS-PAGE usando um gel de 12% SDS-poliacrilamida (10 x 8 cm) ⁹ (Figura 3A). Efectuar a electroforese em gel a 45 A e 200 V durante 45 min.
8. Concentra-se (por exemplo, utilizando um concentrador comercial) da proteína de fusão do domínio MBP-His-P eluída a uma concentração final de ~ 3 mg / ml. Clivar o domínio de fusão MBP-His-P com HRV-protease 3C durante a diálise contra 2 L de 10 mM de tampão de imidazol (~ 1: 100) durante a noite a 4 ° C (Figura 3A). Dependendo do volume final de proteína concentrada, executar a diálise numa cassete de diálise ou tubo de diálise.
   Nota: A quantidade de HRV-3C protease para a proteínaclivagem é calculado de acordo com a actividade de protease específica (2 U / ml, 1 U é suficiente para clivar 100 ug de proteína) e a quantidade de proteína de fusão eluida, que varia de acordo com o nível de expressão e pode ser calculada a partir dos resultados de SDS-PAGE (3,7 ).

4. ^2º Passo de Purificação

1. Equilibrar as Ni-grânulos do passo 3.6 em tampão de imidazol 10 mM.
2. Incubar a proteína dialisada a partir do passo 3.7 (contendo o domínio clivada P, proteína MBP, e HRV-protease) com as esferas de Ni-equilibradas (4.1) durante 30 min a 4 ° C com rotação lenta.
3. Aplicar a mistura de Ni com pérolas para uma coluna e recolher o fluxo de passagem (P domínio clivado) (Figura 3B). Medir a concentração de proteína, uma vez que vem a sair da coluna até que a OD _{280 nm} alcança ~ 0,1.
   Nota: O MBP-His deve permanecer ligado ao NI-grânulos (Figura 3B).
4. Verifique a presença de domínio clivada P usando SDS-PAGE com um 1Gel de 2% tal como descrito anteriormente (Figura 3B). Concentra-se o domínio de P ~ eluída a 3 mg / ml e diálise durante a noite a 4 ° C contra GFB para subsequente purificação SEC.

5. ^3º Passo de Purificação

1. Bombas de lavagem e tubos do sistema de purificação de HPLC e pré-equilibrar a SEC-coluna (ver Lista de Materiais) com GFB.
2. Injectar o domínio de P para a coluna a uma taxa de fluxo de 1 mL / min usando uma Superloop (até 12 ml) ou ciclo (até 3 ml), dependendo do volume da amostra concentrada. Após a injecção está terminada, aumentar a taxa de fluxo de 2,5 ml / min.
3. Como o OD aumenta e o domínio P sai da coluna, recolher fracções de 1,5 ml. Verificar fracções utilizando SDS-PAGE com um gel de 12% (Figura 4A e 4B). Piscina apenas o mais puro fracções e concentrar para ~ 3 mg / ml e ~ 8 mg / ml.
   Nota: Depois de ~ 110 ml (volume vazio) a maioria das impurezas são eluídos a partir de uma coluna SEC com um volume de 320 ml cama. odomínio P é normalmente eluida como um dímero. A eluição tempo / volume do dímero de domínio P é dependente do grau de preparação (pg) da coluna SEC.

6. A cristalização do P Domínio

1. Usar o domínio P ~ em 3 mg / ml e 8 mg / ml para a triagem inicial de cristalização. Preparar pelo menos 100 l de domínio P per concentração para telas iniciais com 384 condições de triagem disponíveis comercialmente. Realizar a triagem a 18 ° C em um formato de placa de 96 poços, em que o reservatório contém 100 ul de solução mãe e uma gota é composta de solução mãe de 0,2 uL e 0,2 uL de proteína.
2. Repetir e otimizar as condições de cristalização de sucesso. Portanto, use placas de 15 poços que contêm 3 linhas. Configure a primeira linha com uma solução mãe de 100%, a segunda fila com uma solução de 90% mãe e 10% de água, e a terceira fila com uma solução mãe 80% e 20% de água. Use um tamanho de gota de 2 ul (1 ml solução mãe de proteína + 1 ml) e 50081; l de solução-mãe como um volume do reservatório.
3. Use condições de cristal otimizados para co-cristalização do domínio P com ligantes. Prepare placas conforme descrito em 6.2. Em vez de 2 ul de tamanho de gota, configurar gotas contendo 1 ul solução mãe, 1 ul de proteína, e 1 ul de ligando numa concentração de 1 mg / ml.
4. Recolher conjuntos de dados de um único cristal usando radiação síncrotron. Realizar a substituição molecular utilizando estruturas de domínio P publicados com uma similaridade de sequência alto quanto inicial ^6,10-13 busca modelo.
   Nota: A presença de um ligando mostra-se como blob modelados-un de densidade de elétrons.

Resultados

O esquema do protocolo descrito está representado na Figura 1. O protocolo de cobre 6 partes principais que incluem a clonagem do gene alvo, a expressão, purificação de três passos, e cristalização. A Figura 2 ilustra o desenho da construção de expressão (CE) e características do vector de expressão pMalc2x. A sequência do local de clonagem múltipla (MCS) do vector pMalc2x mostra locais de clivagem de restrição e da protease. A Fi...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para a expressão e purificação de domínios P ​​norovírus em alta qualidade e quantidade. Noroviruses não está bem estudada e os dados estruturais são continuamente necessário. Para o nosso conhecimento, a produção de domínio P usando outros protocolos (por exemplo, domínios P marcado com GST) tem sido problemática, até agora, e dados estruturais suficientes sobre a interação norovirus-host tem sido ausente. Com o método descrito aqui, que recentemente contrib...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products