İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

Özet

Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp).

Özet

norovirus kapsid tek büyük yapısal protein oluşur, VP1 olarak adlandırılır. VP1, bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki bölünür. S etki P etki formları S etki viral sivri ise, viral RNA etrafında bitişik iskele oluşturan ve antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri belirleyicilerini içerir. P etki, yani., Düşünülen histo-kan grubu antijenleri, norovirus enfeksiyonları için önemli olduğu, karbonhidrat yapıları bağlar. Bu protokol, yüksek verimlerle kaliteli norovirus P etki üretmek için bir yöntem tarif eder. Bu proteinler daha sonra antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri incelemek üzere X-ışını kristalografisi ve ELISA için kullanılabilir.

P alan ilk bir ekspresyon vektörü içine klonlanabilir ve bakterilerde ifade edilmektedir. Protein, metal iyon afinite kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi immobilize barındırır üç adım kullanılarak saflaştırılır. İçindeilkesi, ekspres, klonlama arındırmak ve bu protokol yeni ortaya çıkan norovirus suşları analiz etmek için hızlı bir sistem yapar az dört hafta, proteinleri kristalize etmek mümkündür.

Giriş

İnsan Noroviruses akut gastroenterit, dünya çapında ¹ başlıca nedenidir. Bu virüsler Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus ve Nebovirus dahil olmak üzere en az beş cins, var olan Calıcıvırıdae ailesine aittir. sağlık sisteminin ve geniş dağılımı üzerindeki yüksek etkisine rağmen, insan Noroviruses çalışma sağlam bir hücre kültürü sisteminin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Bugüne kadar hiçbir onaylı aşılar veya antiviral stratejiler vardır.

Norovirus majör kapsid proteini, VP1 olarak da adlandırılan bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki ² ayrılabilir. P etki esnek menteşe (H) bölgeye göre S etki alanına bağlıdır. P etki viral kapsid dıştaki bölümünü oluşturur oysa S etki, viral RNA etrafında bir iskele oluşturur. bakterilerde ifade edildiğinde P etki biyolojik ilgili dimerleri içine toplanır. Öimer karbonhidrat yapıları ile etkileşim, tükürük çözünür antijenler olarak mevcut ve belirli konakçı hücreler ³ bulundu olan histo-kan grubu antijenleri (HBGAs) olarak adlandırılan. P etki alanı HBGA etkileşim enfeksiyonu ⁴ için önemli olduğu düşünülmektedir. Nitekim, son bir rapor sentetik HBGAs veya in vitro ⁵ insan norovirus enfeksiyonu için bakteri HBGA-ifade önemini ortaya koymuştur.

Noroviruses konakçı hücre eki ile ilgili Güncel çalışmalar çoğunlukla böcek hücrelerinde veya Escherichia coli (E. Coli) 'de eksprese edilen rekombinant P alanları ile ifade edilebilir virüs benzeri partiküller (VLP'ler) ile gerçekleştirilmiştir. atomik çözünürlükte P etki alanı HBGA etkileşimleri anlamak için, P etki-HBGA kompleks yapıların X-ışını kristalografisi kullanılarak çözülebilir. Burada, yüksek miktarda ve kalitede P alanının üretimi X-ışını da kristalin için kullanılmasına imkan verir P alan ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklarcoğrafyayı. Dahası, bu yöntem, diğer calicivirüs P alanları ve yapısal olmayan proteinler için uygulanabilir.

P etki E. için kodon optimizasyonu E. coli sentezleme ve standart bir aktarım vektörü içine klonlandı. P alanı daha sonra, bir polihistidin bölgesini (His) etiketi ve bir proteaz bölünme sitesi tarafından takip edilen mannoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir ekspresyon vektörü içine yeniden klonlanmıştır. MBP-His-P alanı füzyon proteini E. ifade edilir E. coli, üç saflaştırma kademesi takip. MBP-His-P alanı füzyon proteini hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi (IMAC) kullanılarak saflaştırılır. Daha sonra, füzyon proteini, insan rinovirüs (HRV) -3C proteaz ve P alanı ayrılır yarılır MBP-His ek IMAC saflaştırma aşaması. Son olarak, P alan boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. saflaştınldı P alan X-ışını kristalografisi için kullanılabilir. Protein kristalizasyon koşullarına taranması perfo olanFarklı P domain proteini konsantrasyonları kullanılarak piyasada mevcut tarama kitleri ile rmed. Kristal büyüme gözlenir ve en umut verici koşullar optimize edilmiştir.

yöntemleri burada tarif ile, en az dört hafta içinde yapısı proteine ​​gen gitmek mümkündür. Bu nedenle, P etki ifadesi, saflaştırma ve kristalizasyon bizim yöntem moleküler düzeyde norovirus-host etkileşimi incelemek ve up-to-date aşı tasarımı ve ilaç tarama yardımcı olmak için önemli veri sağlamak için uygundur.

Protokol

1. P Alan Klonlama

1. Norovirus soylarının dizi hizalama P etki kodlama bölgesini belirlemek (örneğin, GII.10 suşu, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) ^6. Ayrıca, p alan (Şekil 2A) C-terminal ucunda, esnek bölümünün ayrılması. E için DNA kodon-optimize E. coli ekspresyonu ve BamHI alt-klonlamak için (N-terminal) ve Notl (C-ucu) sınırlama sitelerini pMalc2x sentezleme vektörü ^6,7 bölgeyi kodlayan P alanı bulunmaktadır.
   Not: P alan kodlama bölgesi optimize edilmiş ve ticari bir hizmet tarafından sentezlenir. bölge (insert) kodlama P etki yaklaşık 1 uzunluğunda kb ve standart bir transfer vektörü teslim olduğunu.
2. Her 1 ul, BamHI (20,000 U / ml) ve Notl (10,000 U / ml) sınırlama üreticisi tamponlar birlikte 37 ° C 'de 1 saat boyunca enzimler ile transfer vektörü 2 ug Digest.
3. bir% 1 agaroz jeli üzerinde sindirildi insert Ayrıve 135 V'da 20 dakika boyunca, bir ticari kit kullanılarak kolloidden uç DNA arındırmak.
4. her biri 1 ul BamHI (20,000 U / ml) ve Notl (10,000 U / ml) bir kısıtlama, 37 ° C'de 1 saat boyunca enzimleri bu vektörün 2 ug sindirerek pMalc2x ekspresyon vektörü hazırlanır. (1.3) yukarıda tarif edildiği gibi bir agaroz jelinden vektör saflaştınlır. Not: her iki numune (1.2 ve 1.4) -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
5. Oda sıcaklığında (RT) (Şekil 2B ve 2C), 15 dakika boyunca 1 ul T4 DNA ligazı (400,000 U / mL) ile, BamHI ve Notl sınırlama mevkilerinde sindirilmiş pMalc2x vektörüne saflaştırılmıştır ekleme Arter. uç oranı 1: 3 (molekül ağırlığı) pMalc2x vektör ve bir vektör, en az 20 ng kullanımı. Bağlama karışımı genellikle ~ 20 ul.
6. 50 ul kimyasal yeterli E. içine ligasyon karışımı 2 ul Transform E. coli DH5α standart transformasyon protokolü (buz üzerinde 10 dakika, ısı şoku 42 ° C'de 45 saniye) kullanarak, bakteri hücreleri ve 600 büyür37 ° C'de 1 saat boyunca ul SOC ortamı. Santrifüj dönüştürülmüş hücreler 1,000 xg'de 3 dakika boyunca, supernatant atmak ve SOC ortamı 30 ul pelletini.
   1. seçimi için, 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB-agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı plakası ve 37 ° C'de gece boyunca büyür. en az beş koloni seçin.
7. Beş kolonilerin her biri için, 50 ug / ml ampisilin (amp LB-) ile desteklenmiş LB-ortamı 2-3 ml kültürü inoküle ve 37 ° C'de 160 rpm'de bir gece boyunca çalkalanarak büyür.
8. ticari bir kit kullanılarak gece boyunca kültürden plazmidler ekstrakte edin. Bir pMalc2x ileri primer (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') ile dizilenerek P alanı, ek maddenin varlığını doğrulamak ve ters primer (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

2. P Alan İfade

1. MBP-His-P etki alanı için pMalc2x vektör kodlama - (400 ng / ml 150 ng / ul) 1 ul Transformyeterli E., 50 ul olarak füzyon proteini, Standart bir transformasyon protokolü (buz üzerinde 10 dakika, ısı şoku 42 ° C'de 45 saniye) kullanılarak E. coli BL21 hücreleri ve 37 ° C 'de 1 saat süre ile 600 ul SOC ortamında büyür. gece boyunca 160 rpm'de ve 37 ° C'de LB-amp 120 ml Alt kültür.
2. Altkültür (: 100 1) ile LB-amp (1.5 L ortamı ile her örneğin 6 x 5 L şişeleri), dokuz litre aşılamak. 0.6 - _OD600 0.4 ulaşana kadar 160 rpm'de ve 37 ° C de çalkalanarak hücrelerin büyütün. Daha sonra, yaklaşık 1 saat boyunca 22 ° C'ye kadar sıcaklık daha düşük ve daha sonra izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid 0,66 mM (IPTG) ⁸ protein ifadesini teşvik eder. gece boyunca 22 ° C (~ 18 saat) hücreler büyütün.
   Sıcaklık, çeşitli olabilir, ancak, 22 ° C veya daha düşük kullanımı önerilir: edin.
3. santrifüj ile (10.543 xg, 15 dakika, 4 ° C) hücreler hasat edilir. Süpernatantı atın ve -20 ° C'de hücre pelletini dondurmak.

3. ^1. saflaştırma adımı ve proteaz parçalama

1. deneylerin tekrarlanabilirliği ve istikrarı garanti altına almak için hisse senedi çözümlerinden protein saflaştırma adımları sırasında kullanılan tamponlar hazırlamak. hareketsiz metal iyonu yakınlık kromatografisi için dört farklı tamponlar (IMAC), imidazol farklı bir konsantrasyonunu ihtiva eden her bir (10 mM, 20 mM, 50 mM ve 250 mM) hazırlayın. SEC için, daha yüksek bir tuz konsantrasyonuna sahip bir jel filtrasyon tamponu (GFB) maddesinin hazırlanması, ancak imidazol yoktur. iyonu giderilmiş su kullanarak ve 0.45 um'lik bir gözenek büyüklüğüne sahip kullanımdan önce tüm tamponları filtre.
   Not: detaylı tampon hazırlanması Şema için Tablo 1 'e bakın.
2. dokuz litrelik kültür hücre pelletini çözülme ve 4 ° C'de 150 mi, PBS içinde çözülür. Hücreleri bozmaya hücre süspansiyonu 2 dakika (güç 130 W, genlik% 20, darbe frekansı% 50) için üç kez sonikasyon. sonikasyon sırasında buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
3. SantrifüjGE sonike hücre süspansiyonu (43.667 xg, 30 dakika, 4 ° C) olarak tanımlanan bir proteini ihtiva eden yüzer hücre artıkları ayırmak için. Süpernatant toplayın ve pelet atın.
4. Yıkama ve Nikel (Ni), bir kromatografi kolonu 10 mM imidazol tamponu -NTA agaroz boncuklar 10 ml (= 1 kolon hacminde [CV]) bulamaç dengelenmesi. Aşama 3,3 süpernatana dengelenmiş Ni boncuk ekleyin MBP-His-P alanı füzyon proteini olarak ifade ve yavaş dönme ile, 4 ° C'de 30 dakika inkübe içeren.
5. İnkübasyondan sonra, bir kromatografi kolonuna, tüm Ni-Boncuk protein karışımı uygulanır. 10 mM, 20 mM, 10 mM, daha sonra 20 mM son 50 mM (Şekil 3A) ile başlanarak, 50 mM imidazol tampon her biri 5 CV ile yavaş yavaş sütundan yıkanır.
6. 250 mM imidazol tamponu (Şekil 3A) kullanılarak MBP-His-P alanı füzyon proteinini ayrıştırmak. Elüsyon süresince, füzyon proteininin elüsyon (OD ₂₈ artış doğrulamak için OD _280nm kontrol0nm). OD _280nm ~ 0.1 düşene kadar elüsyon devam edin. 10 mM imidazol tamponu en az 10 CV ardından 250 mM imidazol tamponu (en az 10 CV) aşırı miktarda boncuk yıkayın. İkinci saflaştırma aşamasından (bölüm 4) için boncuk kaydedin.
7. % 12 SDS-poliakrilamit jeli (10 x 8 cm) ⁹ (Şekil 3A) kullanılarak SDS-PAGE ile MBP-His-P alanı füzyon proteininin varlığını kontrol edin. 45 A jel elektroforezi gerçekleştirmek ve 45 dakika için 200 V.
8. ~ 3 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar (ticari konsantratör kullanılarak, örneğin) elüe MBP-His-P alanı füzyon proteinini konsantre edilir. (~ 1: 100), 10 mM 2 L karşı diyaliz sırasında imidazol tampon HRV-3C proteazı ile MBP-His-P alanı füzyon klivaj gece boyunca 4 ° C'de (Şekil 3A). Konsantre edilen protein nihai hacmine bağlı olarak, bir diyaliz kaseti veya diyaliz tübüne diyaliz gerçekleştirin.
   Not: proteini için HRV-3C proteaz miktarınıbölünmesi belirli bir proteaz aktivitesi göre hesaplanır ve ifade düzeyinde değişiklik ve SDS-PAGE sonuç tahmin edilebilir temizlenen füzyon proteinin bir miktar (3,7 (2 U / ul, 1 U-100 protein ug parçalamak için yeterlidir) ).

4. ^2. saflaştırma adımından

1. 10 mM imidazol tamponu içinde adım 3.6 Ni-boncuk dengelenmesi.
2. Yavaş rotasyon ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca dengeye Ni-boncuk (4.1) ile (ayrıldı P alan MBP protein ve HRV-proteaz ihtiva eden) aşama 3,7 Diyaliz edilen protein inkübe edin.
3. Bir sütuna Ni-boncuk karışımı uygulayın ve flow-through (bölünmüş P etki) (Şekil 3B) toplamak. OD _280nm ~ 0.1 ulaşana kadar sütun kapalı geliyor gibi protein konsantrasyonu ölçün.
   Not: MBP-His Ni-boncuk (Şekil 3B) bağlı olarak kalır.
4. 1 ile SDS-PAGE kullanılarak bölünmüş P etki varlığını kontrol% 2 jeli (Şekil 3B), yukarıda tarif edilen. ~ 3 mg / ml ila elüt P alan konsantre edin ve daha sonra saflaştırma için SEC GFB karşı 4 ° C de bir gece boyunca diyaliz.

5. ^3. saflaştırma adımından

1. Yıkama pompaları ve HPLC arıtma sisteminin boruları ve ön denge SEC-sütunu GFB ile (Malzeme Listesine bakınız).
2. Konsantre edilmiş örneğin hacmine bağlı olarak, 1 ml (3 ml kadar) süper-(en fazla 12 mi) ya da öze kullanılarak / dakikalık bir akış hızında kolona P alan enjekte edilir. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, / dakika 2.5 ml akış oranı.
3. OD artar ve p alan sütun dışan geldiğinde, 1.5 ml fraksiyonlar toplanır. % 12 jel ile SDS-PAGE kullanılarak fraksiyonların kontrol (Şekil 4A ve 4B). Havuz yalnızca en saf parçalar ve • 3 mg / ml ve • 8 mg / ml olacak şekilde konsantre edilir.
   Not: 110 ° sonra, ml (boşluk hacmi) en yabancı maddeler 320 ml yatak hacmi ile SEC kolonundan elüte edilir.P alanı genellikle bir dimer halinde elüt edilmiştir. P alanı dimerinin elüsyon zaman / hacim SEC kolonunun hazırlık derecesindeki (PG) bağlıdır.

P Domain 6. Kristalleşme

1. Başlangıç ​​taraması için kristalizasyon ~ 3 mg / ml ve 8 mg / ml'de p alan kullanın. 384 piyasada mevcut tarama koşulları ile ilk ekranlar için konsantrasyon başına P etki en az 100 ul hazırlayın. Rezervuar ana çözelti 100 ul ihtiva eden bir 96-yuvalı plaka formatı, 18 ° C de bir tarama yapmak ve bir damla 0.2 ul ana çözelti ve 0.2 ul protein oluşmaktadır.
2. Tekrarlayın ve başarılı kristalleşme koşulları optimize. Bu nedenle, 3 satır içerecek 15-kuyu tabak kullanın. % 100 ana çözelti,% 90 anne solüsyonu ve% 10 su ve% 80 anne solüsyonu ve% 20 su ile üçüncü sırada ikinci satır ile ilk sırayı ayarlayın. 2 ul (1 ul protein + 1 ul anne çözelti) ve 500 bir damla boyutu kullanın81; bir hazne hacmi ana çözelti l.
3. ko-kristalize ligandlar P etki alanı için optimize kristal koşullarını kullanın. 6.2 de tarif edildiği gibi tabak hazırlayın. Bunun yerine 2 | il damla boyutu, 1 ul ana çözelti, 1 ul protein ve 1 mg / ml'lik bir konsantrasyonda ligandın 1 ul ihtiva eden damla ayarlayın.
4. sinkrotron radyasyon kullanarak tek kristallerin veri setleri toplayın. Ilk arama modeli ^6,10-13 gibi yüksek sekans benzerliği ile yayınlanan P alan yapıları kullanılarak moleküler değiştirme gerçekleştirin.
   Not: Bir ligand varlığı elektron yoğunluğunun un modellenmiştir blob olarak gösterir.

Sonuçlar

Tarif edilen protokol şematik Şekil 2. Protokol hedef genin klonlanması, ekspresyonu, üç aşamalı bir saflaştırma ve kristalizasyon, 6 ana parçaları kapsamaktadır., Şekil 1 'de gösterilen sentezleme konstruktunun tasarımını görüntülemektedir (AT) ve pMalc2x ifade vektörünün özellikleri. PMalc2x vektörünün çoklu klonlama bölgesinin (MCS) dizisi sınırlama ve proteaz parçalama sitesi gösterir. Şekil 3, i...

Tartışmalar

Burada yüksek kalite ve miktar norovirus P etki ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklar. Noroviruses iyi çalışılmış değildir ve yapısal verileri sürekli ihtiyaç vardır. Bildiğimiz kadarıyla, diğer protokolleri (örneğin, GST-etiketli P alanları) kullanarak P etki üretimi bugüne kadar, sorunlu olmuştur ve norovirus-konak etkileşimi yeterli yapısal verilerin eksik edilmiştir. yöntem burada açıklanan, biz son zamanlarda bağlayıcı karbohidrat norovirusa moleküler ay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products