人类诺沃克病毒凸，域的生产<em&gt;电子。大肠杆菌</em&gt; X射线晶体学

摘要

在这里，我们描述了一个方法来表达和纯化高品质的诺如病毒在突出E.（P）域大肠杆菌在X射线晶体学研究中的使用。这种方法可以被应用到其它杯状病毒P域，以及非结构蛋白， 即 ，病毒蛋白基因连接的（VPG），蛋白酶，和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp的）。

摘要

诺罗病毒衣壳是由一个单一的主要结构蛋白，称为VP1。 VP1被细分成壳（S）结构域和一个突出（P）的结构域。 S区形成围绕病毒RNA的连续支架，而在P域形式上的S域病毒尖峰和包含抗原和宿主 - 细胞相互作用的决定因素。在P域结合碳水化合物结构， 即 ，HISTO-血型抗原，其被认为是对诺罗病毒的感染很重要的。在这个协议中，我们描述了在高产率生产高品质的诺罗病毒P域的方法。这些蛋白质然后可以为了研究抗原性和宿主 - 细胞相互作用被用于X射线晶体和ELISA。

在P域首先克隆到一种表达载体，然后在细菌中表达。该蛋白质是使用涉及固定的金属离子亲和层析和大小排阻层析三步纯化。在原则上，它可以克隆，表达，纯化，并在不到四个星期，这使得该协议分析新出现的诺如病毒株快速系统结晶的蛋白质。

引言

人类诺如病毒是急性胃肠炎全球¹的主要原因。这些病毒属于杯状病毒家族，其中至少有5属，包括诺如病毒 ， 沙波病毒 ，Lagovirus，Vesivirus和Nebovirus。尽管医疗系统，分布范围广对他们的高冲击，诺如病毒的人的研究是由缺乏强有力的细胞培养系统而受到阻碍。迄今为止，没有可批准的疫苗或抗病毒药物策略。

诺罗病毒主要衣壳蛋白，称为VP1，可分为一个壳（S）结构域和一个突出（P）的结构域^2。在P域被连接到由柔性铰链（H）的区域中的S结构域。 S区形成围绕病毒RNA的支架，而在P域构成病毒衣壳的最外层的一部分。在细菌中表达时在P域组装成生物学相关二聚体。在P（D）定时器与碳水化合物结构相互作用，称为HISTO-血型抗原（HBGAs）中存在如唾液可溶性抗原和某些宿主细胞³中。在P域HBGA相互作用被认为是感染⁴重要。事实上，最近的一份报告表明合成HBGAs或HBGA表达在体外 ⁵为人类诺罗病毒感染的细菌中的重要性。

主要与能够在昆虫细胞或大肠杆菌 （ 大肠杆菌 ）中表达的重组P域被表达的病毒样颗粒（VLPs）执行关于诺如病毒的宿主细胞附着目前的研究。为了理解在原子分辨率为P域HBGA相互作用，P域HBGA复杂的结构可以利用X射线晶体学来解决。这里，我们描述的p域的表达和纯化一种协议，它允许使用用于X射线结晶性生产在高数量和质量P域的地理学。此外，可以应用其它杯状病毒P域和非结构蛋白此方法。

为E.在P域是密码子最佳大肠杆菌表达并克隆到一个标准的转移载体。在P域然后重新克隆到编码聚组氨酸（His）的标签和甘露糖结合蛋白（MBP），其后跟一个蛋白酶切割位点的表达载体。的MBP-他-P结构域融合蛋白在大肠杆菌中表达的大肠杆菌 ，后跟三个纯化步骤。的MBP-他-P结构域融合蛋白是使用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化。接着，该融合蛋白被裂解与人鼻病毒（HRV）-3℃蛋白酶和P域从分离的MBP-他通过额外的IMAC纯化步骤。最后，在P域使用大小排阻层析（SEC）纯化。然后将纯p域可用于X射线晶体。蛋白质结晶条件筛选是PERFORmed指使用不同磷结构域蛋白浓度市售筛查试剂盒。晶体生长观察和最有前途的条件进行了优化。

与这里所描述的方法，有可能从基因去蛋白至小于四周内的结构。因此，我们的P域表达，纯化和结晶的方法是合适的，研究诺罗病毒 - 宿主相互作用在分子水平，并提供重要的数据，以协助在上最新疫苗设计和药物筛选。

研究方案

1等。P域克隆

1. 由诺如病毒毒株的序列比对确定为P域编码区（例如，GII.10株，GenBank中^{:AF504671，PDB-ID:3ONU）6。}此外，在为P域（ 图2A）的C-末端除去柔性区域。密码子优化E.脱氧核糖核酸大肠杆菌表达，包括BamHI位，以（N端）和NotI（C端）限制性位点亚克隆在P域编码区进入pMalc2x表达载体^6,7。
   注意:在P域编码区进行了优化，由商业服务合成。在P域编码区（插入）的长度为约1kb和在标准的转移载体递送。
2. 消化转移载体的2微克每1微升BamHⅠ位（20,000单位/毫升）和NotI（10,000单位/ ml）的限制，在37℃酶1小时与制造商提供的缓冲液。
3. 分隔在1％琼脂糖凝胶上消化插入在135 V，20分钟和纯化从凝胶使用商业试剂盒的插入DNA。
4. 通过消化该载体的2微克每1微升BamHⅠ位（20,000单位/毫升）和NotI（10,000单位/ ml）的限制酶在37℃下1小时，制备pMalc2x表达载体。从琼脂糖凝胶中纯化该载体上述（1.3）中所述。注意:两个样品（1.2和1.4）可以被储存在-20℃。
5. 结扎纯化插入成与1微升的T4-DNA连接酶（400000单位/ ml）在室温（RT）（ 图2B和2C）15分钟的BamHI和NotI限制位点的消化的pMalc2x载体。使用至少20纳克pMalc2x矢量和矢量的:插入比为1:3（分子量）。连接混合物通常是20〜微升。
6. 变换2微升连接混合物的成50μl的化学感受态大肠杆菌 DH5α使用标准转化方案（在冰上10分钟，热休克在42℃45秒）的细菌细胞和生长在600为在37℃1小时微升SOC培养基。离心转化的细胞在1000 xg离心3分钟，弃去上清液，并且重悬沉淀在SOC培养基30微升。
   1. 板在LB琼脂平板上转化混合物，含有100μg/ ml氨苄青霉素选择，并在37℃下生长过夜。选择至少五殖民地。
7. 对于每一个的五个菌落，接种补充有50μg/ ml的氨苄青霉素（LB-AMP）的LB培养基2-3毫升培养并通过在37℃下以160 rpm振摇过夜生长。
8. 提取使用商业试剂盒从过夜培养物中的质粒。验证在P域插入物的存在通过测序用pMalc2x正向引物（5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3'）和反向引物（5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3'）。

; 2.P域表达式

1. 变换1微升 - 为MBP-他-P域pMalc2x矢量编码（150纳克/微升400毫微克/微升）融合蛋白进入50微升感受态的使用标准的转化方案（10分钟在冰上，热休克在42℃45秒） 的大肠杆菌 BL21细胞，并在37℃下生长在600微升SOC培养基1小时。传代培养到在160的转速和37℃下过夜120毫升LB-放大器。
2. 接种9升（每1.5升介质如 6×5升烧瓶）的LB放大器与继代培养（1:100）。生长的细胞在160转和37℃振荡直至OD ₆₀₀达到0.4 - 0.6。随后，降低温度到22℃〜1小时，然后诱导蛋白表达与0.66毫异丙基β-D-硫代半乳糖苷的^{（IPTG）8。}生长的细胞在22℃（〜18小时）过夜。
   注:温度可以是多种多样的，但我们建议使用22℃或更低。
3. 通过离心收获细胞（10543 xg离心，15分钟，4℃）。弃去上清液并在-20℃冷冻细胞沉淀。

3。 1 ^日纯化步骤和蛋白酶切割

1. 准备被在蛋白质纯化步骤使用从储备溶液来保证实验的重复性和稳定性缓冲器。准备用于固定化金属离子亲和层析四个不同的缓冲器（IMAC），每个包含咪唑的不同浓度（10毫米，20毫米，50毫米和250毫米）。对于SEC，具有较高的盐浓度准备凝胶过滤缓冲液（GFB），但没有咪唑。使用去离子水，并用0.45微米的孔尺寸在使用前过滤所有缓冲区。
   注意:对于详细的缓冲准备方案，请参考表1。
2. 解冻从九个升培养细胞沉淀，并在4℃下在150毫升PBS中溶解。超声处理的细胞悬浮液2分钟（功率130 W，振幅20％，脉冲频率50％）三次，以破碎细胞。保持冰细胞悬浮液在超声。
3. CentrifuGE的超声处理细胞悬浮液（43667 xg离心，30分钟，4℃）以细胞碎片从含有表达蛋白的上清液中分离出来。收集上清液并弃沉淀。
4. 洗涤和平衡的镍（Ni）的-NTA琼脂糖珠与层析柱10mM咪唑缓冲液中的10ml（= 1个柱体积[简历]）浆料。将平衡的Ni珠粒从步骤3.3添加到上清液含有表达MB​​P-他-P结构域的融合蛋白，并在4℃下缓慢旋转温育30分钟。
5. 孵育后，将整个镍珠蛋白混合物应用于层析柱。用10mM，20mM的，和50mM咪唑缓冲液，开始用10mM，然后为20mM和最后的50mM（ 图3A）的各5个CV慢慢洗柱。
6. 洗脱用250mM咪唑缓冲液（ 图3A）的MBP-他-P结构域融合蛋白。期间洗脱，检查OD _280nm的验证融合蛋白的洗脱（在外径₂₈的上升0nm）。继续洗脱直到OD _280nm处下降到0.1〜。用过量的250mM咪唑缓冲液（至少10的CV）中，接着的10mM咪唑缓冲液的至少10的CV洗珠。除第二纯化步骤（第4）珠。
7. 使用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10×8厘米^）9（ 图3A）验证的MBP-他-P结构域融合蛋白与SDS-PAGE的存在。 45 A上进行凝胶电泳和45分钟200伏。
8. 集中（ 例如，使用市售的集中器）洗脱MBP-他-P结构域融合蛋白，以〜3毫克/毫升的最终浓度。切割MBP-他-P结构域融合以HRV-3C蛋白酶透析期间对2升的10mM咪唑缓冲液（〜1:100），在4℃（ 图3A）过夜。取决于浓缩的蛋白质的最终体积，在透析盒或透析管进行透析。
   注:HRV-3C蛋白酶对蛋白质的量裂解是根据特定蛋白酶活性计算（2U /微升，1单位是足以切割100μg蛋白），并且在表达水平而异，可以从SDS-PAGE的结果来估计洗脱融合蛋白质的量（3.7 ）。

4. ^第二纯化步骤

1. 从步骤3.6中的10mM咪唑缓冲液中平衡的Ni珠。
2. 孵育来自步骤3.7（含有裂解P域，MBP蛋白，和HRV蛋白酶）与平衡的Ni-珠（4.1）处理30分钟，在4℃下缓慢旋转透析蛋白质。
3. 镍珠混合物应用到柱并收集流过（切断P域）（ 图3B）。测量蛋白质的浓度，直到OD _280nm处达到〜0.1脱落的列。
   注意:MBP-他应该保持结合到镍珠（ 图3B）。
4. 检查切开的P域的使用SDS-PAGE的存在下用12％凝胶上述（ 图3B）中所述。浓缩洗脱的P域至〜3毫克/毫升，并在4℃下针对GFB透析过夜随后SEC纯化。

5. ^第三纯化步骤

1. 清洗泵和​​高效液相色谱净化系统管道和预平衡的SEC柱（见材料列表）与GFB。
2. 注入在P域到柱以1ml使用超容量（高达12毫升）或环（高达3毫升）/分钟的流速，这取决于浓缩的样品的体积。注射完成后，增加流速2.5毫升/分钟。
3. 随着OD增加和P域脱落柱，收集1.5ml的分数。检查使用SDS-PAGE的级分用12％凝胶（ 图4A和4B）。池只有最纯的级分并浓缩至约3mg / ml和〜8毫克/毫升。
   注意:在〜110毫升（空隙体积）大多数杂质从与320毫升床体积的SEC柱洗脱。该P域通常洗脱二聚体。在P域二聚体洗脱时间/体积依赖于SEC柱上的制备级（PG）。

6.在P域的结晶

1. 使用在约3毫克/毫升和8毫克/毫升为初始结晶筛选在P域。至少准备100微升每个浓度的P域与384市售的筛选条件初始屏幕。在18℃在96孔板格式，其中所述贮存器包含100微升母液进行筛选和下降是由0.2微升母液和0.2微升的蛋白质。
2. 重复和优化成功的结晶条件。因此，使用包含3排15孔板中。设置的第一行以100％母液，第二行用90％母液和10％的水，并在第三排具有80％母溶液和20％的水。使用2微升（微升1蛋白+ 1μL母液）和500的墨滴大小81;母液作为一个水库容积L。
3. 使用优化结晶条件，共结晶与配体在P域。在6.2中所述准备板。代替2-微升液滴尺寸，设置含有1μl的母液，1μl的蛋白质，并以1mg / ml的浓度1微升的配体的下降。
4. 收集利用同步辐射单晶的数据集。使用公开的P结构域具有高序列相似性作为初始搜索模型^6,10-13进行分子置换。
   注:配体的存在显示为电子密度的未建模斑点。

结果

所描述的协议的示意图在图1中描绘的协议包括6个主要的部件，其中包括所述靶基因的克隆，表达，一个三步纯化和结晶。 图2示出了表达构建体的设计（EC）和在pMalc2x表达载体的特点。所述pMalc2x载体的多克隆位点（MCS）的序列显示限制和蛋白酶切割位点。 图3示出的MBP-他-P结构域融合蛋白的代表性的SDS-PAGE结果和裂解P域与前两个的相...

讨论

在这里，我们描述了诺如病毒P域的高品质和数量表达和纯化的协议。诺如病毒没有很好地研究，不断需要的结构数据。据我们所知，使用其它协议（ 例如 ，GST标签P域）p域的生产一直是个问题，到目前为止，并在诺如病毒宿主相互作用足够的结构数据已经丢失。与这里所描述的方法，我们最近显著贡献的诺如病毒的分子细节的理解糖结合。本协议可以适于多种蛋白质。然而，成功地执行?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products