Производство человека Norovirus выступающую Домены в<em&gt; E. палочки</em&gt; Для рентгеновской кристаллографии

Резюме

Здесь мы опишем метод , чтобы выразить и очистить высокое качество Norovirus выступающие (P) доменов в E. палочки для использования в исследованиях рентгеновской кристаллографии. Этот метод может быть применен к другим кальцивируса P доменов, а также неструктурные белки, то есть., Вирусный белок геном-сшитый (ВПГ), протеазы и РНК зависимой РНК - полимеразы (RdRp).

Аннотация

Норовирусная капсид состоит из одного основного структурного белка, названного VP1. VP1 подразделяется на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена. Домен S образует непрерывную леску вокруг вирусной РНК, в то время как P доменных форм вирусные шипы на домене S и содержит детерминанты для антигенности и хост-клеточных взаимодействий. Домен P связывает углеводные структуры, то есть., Групповые антигены гисто-крови, которые считаются важными для норовируса инфекций. В этом протоколе, мы описываем способ получения высококачественных норовирус P домены с высокими выходами. Эти белки могут быть использованы для рентгеновской кристаллографии и ELISA с целью изучения антигенных свойств и хост-клеточных взаимодействий.

Домен Р сначала клонирован в вектор экспрессии и экспрессии в клетках бактерий. Белок очищают с помощью трех шагов, которые включают иммобилизованных металл-ионную аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии. Впринцип, можно клонировать, экспресс, очищают, и кристаллизуются белки менее чем за четыре недели, что делает этот протокол система быстрого анализа вновь возникающих штаммов Norovirus.

Введение

Человеческие Noroviruses являются основной причиной острого гастроэнтерита во всем мире ^1. Эти вирусы принадлежат к семейству Caliciviridae, из которых по крайней мере пять родов, в том числе норовирус, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus и Nebovirus. Несмотря на их высокую воздействие на систему здравоохранения и широкое распространение, изучение человеческих норовирусами затруднено из-за отсутствия надежной системы клеточной культуры. На сегодняшний день нет никаких утвержденных вакцин или противовирусных стратегий, доступных.

Норовирусная основной белок капсида, названный VP1, можно разделить на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена ^2. Домен Р подключен к домену S областью гибкого шарнира (H). Домен S образует леску вокруг вирусной РНК, в то время как домен Р образует дальний от центра часть вирусного капсида. Домен P компонует в биологически соответствующих димеров при экспрессии в бактериях. P dИМЕР взаимодействует с углеводными структурами, называемые антигены групп гисто-крови (HBGAs), которые присутствуют в виде растворимых антигенов в слюне и обнаружили на некоторых клетках - хозяевах ^3. Взаимодействие домена HBGA Р считается важным для инфекции ^4. В самом деле, недавний доклад показал важность синтетических HBGAs или HBGA экспрессирующих бактерии для инфекции норовирусной человека в пробирке ^5.

Современные исследования , касающиеся вложения клетки - хозяина норовирусами в основном осуществляется с вирусоподобных частиц (VLPs) , которые могут быть выражены в клетках насекомых или рекомбинантных P доменов , выраженных в Escherichia coli (E.coli). Для того, чтобы понять P предметно-HBGA взаимодействия с атомным разрешением, P предметно-HBGA сложные структуры могут быть решены с помощью рентгеновской кристаллографии. Здесь мы опишем протокол для выражения Р домена и очистки, что позволяет производить области Р в высоком количестве и качестве, которые будут использоваться для рентгеновской Crystallграфия. Кроме того, этот метод может быть применен для других кальцивируса P доменов и неструктурных белков.

Домен P является кодон-оптимизированной для Е. палочка экспрессии и клонируют в стандартный вектор переноса. Домен Р затем повторно клонирована в вектор экспрессии, который кодирует полигистидиновая (His) тэг и маннозы-связывающий белок (МВР), которые, за которым следует сайт расщепления протеазы. -His-P МВР слитый домен белок экспрессируется в E. палочки, а затем три стадии очистки. Гибридный домен белка ОБМ-His-P очищают с помощью иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии (IMAC). Затем слитый белок расщепляют с человеческим риновирусной (ВРС) -3C протеазы и домен Р отделяется от MBP-His, с помощью дополнительной стадии очистки IMAC. И, наконец, домен Р очищают с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенный домен P может затем использоваться для рентгеновской кристаллографии. Скрининг условий кристаллизации белков является Перфоrmed с коммерчески доступными наборами скрининга с использованием различных концентраций белка P домена. Рост кристаллов наблюдается и наиболее перспективные условия оптимизированы.

С методами, описанными здесь, можно перейти от гена к белку структурировать в течение менее четырех недель. Таким образом, наш метод выражения P домена, очистки и кристаллизации подходит для изучения взаимодействия норовирус-хозяина на молекулярном уровне и обеспечивают важные данные для оказания помощи в последнюю дату разработкой вакцин и наркотиков скрининг.

протокол

1. P Домен Клонирование

1. Определение кодирующей области P домена путем выравнивания последовательностей штаммов норовируса (например, штамм GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) ^6. Кроме того, удалите гибкую область на С-конце домена P (фиг.2А). Кодон-оптимизируют ДНК для E. палочки экспрессии и включают BamHI (N-терминал) и NotI (C-терминал) сайтов рестрикции для того , чтобы суб-клона области Р кодирующей области в вектор экспрессии pMalc2x ^6,7.
   Примечание: Область кодирования Р домен оптимизировано и синтезируются коммерческой службы. Домен P кодирования области (вставка) составляет примерно 1 кб в длину и поставляется в стандартном векторе переноса.
2. Дайджест 2 мкг вектора переноса с каждого 1 мкл BamHI (20000 ед / мл) и NotI (10000 ед / мл), ферменты рестрикции в течение 1 ч при 37 ° С с производителем поставляется буферов.
3. Отделить переваренной вставку на агарозном геле 1%в течение 20 мин при 135 В и очищают ДНК-вставки из геля с использованием коммерческого набора.
4. Готовят вектор экспрессии pMalc2x расщеплением 2 мкг этого вектора с каждым 1 мкл BamHI (20000 ед / мл) и NotI (10000 ед / мл) ферментов рестрикции в течение 1 ч при 37 ° С. Очищают вектор из агарозного геля, как было описано выше (1.3). Примечание: Оба образца (1.2 и 1.4) можно хранить при -20 ° С.
5. Лигирования Очищенную вставку в расщепленного вектора pMalc2x на сайтах рестрикции BamHI и NotI с 1 мкл лигазы Т4-ДНК (400000 ед / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) (рис 2В и 2С). Использование по меньшей мере 20 нг вектора pMalc2x и вектор: вставка соотношение 1: 3 (молекулярный вес). Смесь Лигирование обычно ~ 20 мкл.
6. Transform 2 мкл сшитой смеси на 50 мкл химически компетентную E. палочки DH5 & бактериальные клетки с использованием стандартного протокола преобразования (10 мин на льду, теплового шока 45 сек при 42 ° С) и растут в 600мкл SOC среда в течение 1 ч при 37 ° С. Центрифуга трансформированные клетки в течение 3 мин при 1000 об XG, отбросить супернатант, и ресуспендируют осадок в 30 мкл SOC среды.
   1. Пластинчатый смесь преобразования на LB-чашки с агаром, содержащей 100 мкг / мл ампициллина для селекции, и расти в течение ночи при 37 ° С. Выберите по крайней мере пять колоний.
7. Для каждого из пяти колоний, прививают 2-3 мл культуры LB-среде, дополненной 50 мкг / мл ампициллина (LB-Amp) и растут при встряхивании в течение ночи при 160 оборотах в минуту при 37 ° С.
8. Извлечение Плазмиды из ночной культуры с использованием коммерческого набора. Проверьте наличие P домена вставки путем секвенирования с прямого праймера pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') и обратного праймера (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

Выражение 2. P Домен

1. Transform 1 мкл (150 нг / мкл - 400 нг / мкл) векторного кодирования pMalc2x для MBP-His-P доменслитый белок в 50 мкл компетентную E. Клетки палочки BL21 с использованием стандартного протокола преобразования (10 мин на льду, теплового шока 45 сек при 42 ° С) и растут в 600 мкл SOC среды в течение 1 ч при 37 ° С. Субкультура в 120 мл LB-амп в течение ночи при 160 оборотах в минуту и ​​37 ° С.
2. Привить девять литров (например, 6 х 5 л колб с 1,5 л среды каждая) LB-усилителя с субкультуры (1: 100). Grow клетки качалке при 160 оборотах в минуту и 37 ° С до тех пор , OD ₆₀₀ не достигнет 0,4 - 0,6. Затем снижают температуру до 22 ° С в течение ~ 1 ч и затем индуцируют экспрессию белка с 0,66 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG) ^8. Grow клеток в течение ночи при 22 ° С (~ 18 ч).
   Примечание: температура может быть разнообразным, но мы рекомендуем использовать 22 ° C или ниже.
3. Урожай клеток путем центрифугирования (10,543 XG, 15 мин, 4 ° С). Жидкость над осадком сливают и замораживают осадок клеток при -20 ° С.

3. 1 - ^й Стадия очистки и протеаз Расщепление

1. Подготовка буферов, которые используются во время стадий очистки белка из маточных растворов, чтобы гарантировать воспроизводимость и стабильность экспериментов. Подготовьте четыре различных буферов для ионно-аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC), каждая из которых содержит различную концентрацию имидазола (10 мм, 20 мм, 50 мм и 250 мм). Для SEC, подготовить гель-фильтрационной буфер (CFB) с более высокой концентрацией соли, но без имидазола. С помощью деионизованной воды и фильтровать все буферы перед использованием с размером пор 0,45 мкм.
   Примечание: Для получения детальной схемы подготовки буфера, обратитесь к таблице 1.
2. Растаяйте осадок клеток из литровой культуры девяти и растворяют в 150 мл PBS при 4 ° С. Разрушать ультразвуком суспензии клеток три раза в течение 2 мин (мощность 130 Вт, амплитуда 20%, частота следования импульсов 50%) для разрушения клеток. Держите клеточной суспензии на льду во время озвучивания.
3. CentrifuGE Озвученную суспензии клеток (43667 XG, 30 мин, 4 ° С), чтобы отделить клеточные остатки от супернатанта, содержащего экспрессируемый белок. Соберите супернатант и отбросить осадок.
4. Мытье и уравновешивают 10 мл (= 1 объем колонки [CV]) суспензии никеля (Ni) -NTA агарозных шариков с 10 мМ имидазола буфера в хроматографическую колонку. Добавить уравновешенную Ni бусинки к надосадочной жидкости с этапа 3.3, содержащего выраженный MBP-His-P домен слитого белка и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при медленном вращении.
5. После инкубации применить всю смесь Ni-бусинка-белка в хроматографическую колонку. Промывают колонку медленно с каждые 5 колоночными объемами 10 мМ, 20 мМ и 50 мМ имидазола буферы, начиная с 10 мм, затем 20 мМ , и последние 50 мМ (фиг.3А).
6. Элюции ОБМ-His-P слитый домен белка с использованием 250 мМ имидазола буфера (фиг.3А). Во время элюирования, проверьте OD _{280 нм} , чтобы проверить , вымывание слитого белка (рост OD ₂₈0nm). Продолжайте элюирование до OD _{280 нм} не упадет до ~ 0,1. Промыть шарики с чрезмерным количеством 250 мМ имидазола буфера (по крайней мере, 10 ППО), а затем по крайней мере, 10 колоночными объемами 10 мМ имидазола буфера. Сохраните шарики для второй стадии очистки (раздел 4).
7. Проверьте наличие ОБМ-His-P домен белка , слитого с SDS-PAGE с использованием 12% SDS-полиакриламидном геле в присутствии (10 х 8 см) ⁹ (рисунок 3А). Выполните гель-электрофореза на 45 А и 200 В в течение 45 мин.
8. Концентрат (например, с использованием коммерческого концентраторы) элюированного ОБМ-His-P домен слитого белка до конечной концентрации ~ 3 мг / мл. Сколите домен слияния МВР-His-P с ВСР-3С протеазы во время диализа против 2 л 10 мМ имидазола буфера (~ 1: 100) в течение ночи при 4 ° С (фиг.3А). В зависимости от конечного объема концентрированного белка, выполняют диализ в диализный кассете или диализной трубке.
   Примечание: количество HRV-3C протеазы для белкаРасщепление рассчитывается по удельной активности протеазы (2 ед / мкл, 1 U достаточно, чтобы расщепить 100 мкг белка), и количество вымываемого слитого белка, который изменяется от уровня экспрессии и могут быть оценены из результата SDS-PAGE (3.7 ).

4. 2 - ^й Стадия очистки

1. Уравновешивания Ni-бусинки со стадии 3.6 в 10 мМ имидазола буфере.
2. Выдержите Диализованный белок из шага 3.7 (содержащий расщепляется домен P, белок MBP и HRV-протеазы) с уравновешенной Ni бусинок (4.1) в течение 30 мин при температуре 4 ° С при медленном вращении.
3. Нанесите Ni-шарик смеси в колонну и собирать проточные (расщепляется P домена) (Рисунок 3B). Измерение концентрации белка , как это происходит с колонки до OD _{280 нм} не достигает ~ 0,1.
   Примечание: MBP-His должен оставаться связанным с Ni-шариков (рис 3б).
4. Проверьте наличие домена расщепляют P с помощью SDS-PAGE с 12% гель , как описано выше (фиг.3В). Концентрат элюированного домен Р до ~ 3 мг / мл и диализ в течение ночи при 4 ° C против GFB для последующей очистки SEC.

5. 3 - ^я стадия очистки

1. Мытье насосы и трубопроводы системы очистки ВЭЖХ и предварительно уравновешивают SEC-колонку (см список материалов) с GFB.
2. Вводят области Р на колонку при скорости потока 1 мл / мин с использованием superloop (до 12 мл) или цикл (до 3 мл), в зависимости от объема концентрированного образца. После инъекции закончено, увеличить расход до 2,5 мл / мин.
3. По мере того как OD увеличивается и область P отрывается колонку, собирают фракции 1,5 мл. Проверка фракций с помощью SDS-PAGE с 12% геле (рис 4А и 4Б). Бассейн только чистые фракции и концентрируют до ~ 3 мг / мл и ~ 8 мг / мл.
   Примечание: После ~ 110 мл (объем пустот) большинство примесей элюируют из колонки SEC с объемом 320 мл слоем.домен Р обычно элюируют в виде димера. Элюирование время / объем димера Р домена зависит от степени преп (Pg) колонны SEC.

6. Кристаллизация P домена

1. Используйте домен P на ~ 3 мг / мл и 8 мг / мл для первичного скрининга кристаллизации. Подготовьте по крайней мере, 100 мкл области P в концентрации для начальных экранов с 384 коммерчески доступных условий скрининга. Провести скрининг при 18 ° С в 96-луночного формата пластины, где резервуар содержит 100 мкл маточного раствора и каплю состоит из 0,2 мкл раствора маточного и 0,2 мкл белка.
2. Повторить и оптимизировать успешных условий кристаллизации. Таким образом, использовать 15-луночные планшеты, которые содержат 3 ряда. Установите первую строку с 100% -ным раствором матери, во втором ряду с 90% -ным раствором матери и 10% воды, а в третьем ряду с 80% -ным раствором матери и 20% воды. Используйте размер капли 2 мкл (1 мкл белка + 1 мкл маточного раствора) и 50081; л маточного раствора в объеме резервуара.
3. Используйте оптимизированные условия для кристаллических сокристаллизующееся домен P с лигандами. Подготовка пластин, как это описано в пункте 6.2. Вместо 2 мкл размера капель, установить капли, содержащие 1 мкл раствора маточного 1 мкл белка, и 1 мкл лиганда при концентрации 1 мг / мл.
4. Соберите наборы данных монокристаллов с использованием синхротронного излучения. Выполните молекулярную замену с использованием опубликованных структур P доменов с высоким сходством последовательности в качестве исходной модели поиска ^6,10-13.
   Примечание: Наличие лиганда показывает, как ООН смоделированный сгустка электронной плотности.

Результаты

Схема описанного протокола изображен на рисунке 1. Протокол охватывает 6 основных частей , которые включают клонирование гена - мишени, экспрессия, очистка трехступенчатую и кристаллизацию. Рисунок 2 иллюстрирует конструкцию экспрессионной конструк...

Обсуждение

Здесь мы опишем протокол для экспрессии и очистки норовируса P доменов в высоком качестве и количестве. Норовирусы недостаточно хорошо изучены и постоянно необходимы структурные данные. Насколько нам известно, производство домен P с использованием других протоколов (например, GST-?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products