ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

Summary

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Abstract

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Introduction

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

Protocol

وقد أجريت فصادة الكريات البيض تحت بروتوكول البحث موضوع البشري الموافقة عليها من قبل المعاهد الوطنية للصحة المراجعة المؤسسية متنها.

1. عزل والحفظ بالتبريد من وحيدات

1. الحصول على خلايا وحيدات النوى التي كتبها فصادة الكريات البيض من الجهات المانحة الإنسان، وإثراء حيدات التي كتبها المستمر لمكافحة تدفق الطرد المركزي تصويل من خلايا وحيدات النوى كما هو موضح في المراجع ^7،8. الحصول على ما يقرب من 100 × 10 ⁶ خلايا elutriated (حوالي 80 - 90٪ وحيدات) في المخزن تصويل المحدد من قبل الشركة المصنعة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
2. حيدات أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل البولي بروبلين في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. إزالة طاف وبلطف resuspend الخلايا في FBS تليها سلفوكسيد ثنائي ميثيل لتحقيق تركيز النهائي من 90٪ FBS / 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 50 × 10 ⁶ خلية / مل.
4. إضافة كل مل من تعليق خلية تيس لcryovial الفردية.
5. وضع cryovials في زنزانة تجميد الحاويات ونقل إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة 24 ساعة قبل نقل إلى النيتروجين السائل خزان cryovial للتخزين على المدى الطويل.

2. تمايز الخلايا وحيدة النواة في الضامة

1. ذوبان الجليد في cryovial من الخلايا عن طريق نقل بسرعة إلى 37 درجة مئوية حمام الماء ثم إزالة فورا عند تعليق الخلية قد تحسنت حوالي 70٪.
2. فور الذوبان الكامل في درجة حرارة الغرفة، ونقل 1 مل محتويات cryovial إلى 50 مل من 37 درجة مئوية درجة حرارة المعهد التذكاري روزويل بارك (RPMI) 1640 متوسطة مع 2 مم L-الجلوتامين، 50 نانوغرام / مل M-CSF، 25 نانوغرام / مل انترلوكين 10 (IL-10)، و 10٪ FBS (المتوسط ​​الشامل).
3. نقل 25 مل من تعليق الوحيدات في كل من اثنين من 75 سم ² قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية.
4. احتضان الثقافات في 37 درجة خلية C الثقافة الحاضنة مع 5٪ CO _2/95٪ الجوية لمدة 48 ساعة.
5. شطف مكعبltures 3 مرات مع 10 مل RPMI 1640 المتوسطة (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية)، وإزالة بلطف مستنبت لتجنب طرد أي خلايا فضفاضة يعلق.
6. بعد الشطف، إضافة المتوسطة كاملة جديدة، وتغيير المتوسط ​​كل يوم 2 حتى تفرق حيدات وتتكاثر بما فيه الكفاية لتصبح متموجة. وهذا يتطلب حوالي أسبوع واحد من الثقافة.

3. حصاد الضامة لبدء التجارب

1. شطف الضامة متباينة في قارورة 3 مرات مع 10 مل قبل تحسنت مخزنة المالحة الفوسفات 37 ° C Dulbecco وبدون الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+} قبل إضافة 10 مل 37 ° C 0.25٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) حل قبل تحسنت.
2. مكان قارورة في حاضنة الثقافة خلية ل10-15 دقيقة في الوقت الذي ما يقرب من 90٪ من الضامة يجب أن يكون مقربا ومنفصلة. التحقق من ذلك عن طريق الفحص المجهري للقارورة.
3. إضافة 10 مل من RMPI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS إلى sكبار trypsinization.
4. نقل تعليق خلية بلعم من القارورة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل، الطرد المركزي 300 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف.
5. resuspend بلطف الضامة في 1 مل من المتوسط ​​الشامل.
6. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق خلية بلعم مع 10 ميكرولتر حل التريبان الأزرق وتحديد عدد الخلايا البلاعم وقدرتها على البقاء (عادة> 95٪) باستخدام عدادة الكريات.
7. واستنادا إلى عدد خلايا (عادة حوالي 15 - 18 × 10 ⁵ الضامة)، إضافة المتوسطة كاملة إضافية لتحقيق كثافة الخلية البذر المطلوب. ملاحظة: 1 × 10 ⁵ الضامة في 1.5 مل المتوسطة لكل بئر من لوحة ال 12 أيضا سوف تنتج ثقافة شبه متموجة.
8. بعد غرس البذور، واحتضان الضامة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة الثقافة الخلية مع 5٪ CO _2/95٪ الجوية للسماح مرفق الخلية. ثم، تبدأ التجارب المرجوة.

النتائج

كانت قابلية حيدات الطازجة أو cryopreserved أكبر من 95٪ كما هو محدد مع التريبان الأزرق تلطيخ ⁹ الشكل 1 والشكل 2 مقارنة في تكبير الدنيا والعليا، على التوالي، تقدم الطازجة وcryopreserved (أي المجمدة) الوحيدات التمايز في الضامة. ل...

Discussion

يمكن توليد أنواع بلعم يعرف توضيح بعض نتائج متضاربة التي حصل عليها المحققون عند دراسة علم الأحياء البلاعم. استخدام الظروف ثقافة مختلفة وعوامل التمايز لتوليد الضامة الإنسان الأساسية يمكن أن يؤدي إلى أنواع بلعم مختلفة جدا، وهذه حقيقة قد لا يكون موضع تقدير من قبل الباح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate