Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Resumo

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Resumo

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Introdução

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

Protocolo

Leucaférese foi realizado em protocolo de pesquisa de um sujeito humano aprovado por um National Institutes of Health conselho de revisão institucional.

1. Isolamento e criopreservação de monócitos

1. Obtenção de células mononucleares por leucaferese de dadores humanos, monócitos e enriquecer por contínua contra-fluxo centrifugação elutriação de células mononucleares, tal como descrito nas referências ^7,8. Obter aproximadamente 100 x 10 ⁶ células elutriados (aproximadamente 80 - 90% de monócitos) em tampão de elutriação especificado pelo fabricante. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
2. monócitos de centrifugação em um tubo de 15 ml de polipropileno a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em FBS, seguido de sulfóxido de dimetilo para alcançar uma concentração final de 90% de FBS / 10% de sulfóxido de dimetilo e 50 x 10 ⁶ células / ml.
4. Adicionar cada ml de suspensão de células TO criotubo um indivíduo.
5. Coloque as criotubos num recipiente de congelação de células e transferir para um congelador de -80 ° C durante 24 h antes de transferir para um tanque de armazenamento de azoto líquido criotubo para armazenamento a longo prazo.

2. Diferenciação de monócitos em macrófagos

1. Descongelar um criotubo de células transferindo rapidamente a um banho de água a 37 ° C e, em seguida, imediatamente a remoção quando a suspensão de células foi descongelada cerca de 70%.
2. Imediatamente após a descongelação completa à temperatura ambiente, transferir os 1 ml conteúdo criotubo para 50 ml de 37 ° C aqueceu-se Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 2 mM de L-glutamina, 50 ng / mL de M-CSF, 25 ng / mL interleucina-10 (IL-10), e 10% de FBS (meio completo).
3. Transferir 25 ml de suspensão de monócitos em cada um de dois frascos de 75 cm ² de cultura de células de plástico.
4. Incubar as culturas numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de CO _2/95% de ar durante 48 horas.
5. Lavar o cultures 3 vezes com 10 ml de meio RPMI 1640 (pré-aquecido a 37 ° C), com cuidado de remover o meio de cultura para evitar a retirada quaisquer células fracamente ligados.
6. Após lavagem, adicione meio completo fresco, mudando média a cada 2 dias até monócitos diferenciar e proliferar o suficiente para se tornar confluentes. Isso requer cerca de uma semana de cultura.

3. A colheita em macrófagos para iniciar Experimentos

1. Lavar macrófagos diferenciados em balão de 3 vezes com 10 mL de pré-aquecido solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco a 37 ° C, sem Ca ²⁺ e Mg ²⁺ antes da adição de 10 ml pré-aquecida de ácido etilenodiaminotetra-tripsina solução a 37 ° C 0,25% (EDTA).
2. Colocar o balão numa incubadora de cultura de células para 10 - 15 min, altura em que aproximadamente 90% dos macrófagos deve ter arredondado e individual. Verificar esta através de exame microscópico do balão.
3. Adicionar 10 ml de RPMI 1640 contendo FBS a 10% a stripsinização superior.
4. Transferir a suspensão de células de macrófagos de balão para um tubo de polipropileno de 50 ml, de centrifugação 300 x g durante 5 min, e desprezar o sobrenadante.
5. Suavemente ressuspender os macrófagos em 1 ml de meio completo.
6. Misturar 10 ul de suspensão de células de macrófagos com 10 ul de solução de Azul de Tripano e determinar o número de células de macrófagos e viabilidade (normalmente> 95%), utilizando um hemocitómetro.
7. Com base na contagem de células (usualmente cerca de 15 - 18 x 10 ⁵ macrófagos), adicionar meio completo adicional para atingir a densidade celular desejada semeadura. Nota: 1 x 10 ⁵ macrófagos em 1,5 ml de meio por poço de uma placa de 12 poços de cultura irá produzir um quase confluentes.
8. Após a sementeira, incuba macrófagos durante a noite numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de ar _de CO _2/95% para permitir a fixação das células. Em seguida, começa experiências desejados.

Resultados

A viabilidade de monócitos frescos ou criopreservados foi superior a 95% tal como determinado através da coloração com Trypan Blue ^9. A Figura 1 e a Figura 2 comparar com ampliações inferiores e superiores, respectivamente, o progresso da (isto é, congelada) diferenciação de monócitos frescos e criopreservados em macrófagos. Note que o fresco comparado com monócitos criopreservado mostrar ...

Discussão

Geração de tipos de macrófagos definidas podem esclarecer alguns dos resultados conflitantes obtidos pelos investigadores quando se estuda a biologia dos macrófagos. A utilização de várias condições de cultura e dos factores de diferenciação para geração de macrófagos primários humanos pode conduzir a tipos muito diferentes de macrófagos, um facto que não pode ser apreciado pelo pesquisador. Por exemplo, macrófagos, por vezes, são geradas a partir de monócitos humanos utilizando nenhum soro, soro hum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate