Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

Резюме

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Аннотация

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Введение

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

протокол

Лейкаферез был проведен в соответствии с протоколом исследования человеческого субъекта, одобренного Национальным институтом здравоохранения совета организационного обзора.

1. Выделение и криоконсервации моноцитов

1. Получение мононуклеарных клеток путем лейкаферезом человеческих доноров, и обогащают моноциты путем непрерывного противотока центрифугирование отмучивани мононуклеарных клеток , как описано в ссылках ^7,8. Получают примерно 100 х 10 ⁶ клеток отмученного (приблизительно 80 - 90% моноциты) в буфере сепарации , указанного изготовителем. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
2. Центрифуга моноциты в 15 мл полипропиленовую трубку при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют клетки в FBS с последующим диметилсульфоксида для достижения конечной концентрации 90% FBS / 10% диметилсульфоксиде и 50 х 10 ⁶ клеток / мл.
4. Добавьте каждый мл суспензии клеток то индивидуальной криопробирку.
5. Поместите криопробирки в контейнере морозильную клеток и перенести в -80 ° C морозильнике в течение 24 ч перед переносом в охлаждаемой жидким азотом криопробирку резервуар для хранения для длительного хранения.

2. Дифференциация моноцитов в макрофаги

1. Растаяйте криопробирку клеток путем быстрого перехода на C водяной бане при 37 °, а затем сразу же удаление, когда суспензию клеток оттаивает около 70%.
2. Сразу же после полного оттаивания при комнатной температуре, передача 1 мл криопробирку содержимое в 50 мл 37 ° C нагретый институт Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 с 2 мМ L-глутамина, 50 нг / мл M-CSF, 25 нг / мл интерлейкин-10 (ИЛ-10), и 10% FBS (полная среда).
3. Перенесите 25 мл моноцитов суспензии в каждый из двух 75 см ² пластиковых колбах для культивирования клеток.
4. Инкубируйте культур в культуре клеток С - инкубаторе 37 ° с 5% CO _2/95% воздуха в течение 48 часов.
5. Ополосните у.е.ltures 3 раза с помощью 10 мл среды RPMI 1640 (предварительно нагретом до 37 ° С), осторожно удаления культуральной среды, чтобы избежать каких-либо выбивании слабо прикрепленные клетки.
6. После ополаскивания добавьте свежую полную среду, изменяя среду каждые 2 дня до тех пор, пока моноциты дифференцируются и пролиферируют в достаточной степени, чтобы стать вырожденная. Для этого требуется около одной недели культуры.

3. Сбор Макрофаги инициировать эксперименты

1. Промыть дифференцированные макрофаги в колбу 3 раза с помощью 10 мл подогретого фосфатно-буферном солевом растворе 37 ° C В Дульбекко без Са ²⁺ и Mg ²⁺ , перед добавлением 10 мл подогретого 37 ° С 0,25% раствора трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
2. Поместите колбу в культуре клеток инкубаторе в течение 10 - 15 минут, после чего примерно 90% макрофагов, должны иметь закругленные и отсоединяются. Проверьте это микроскопическое исследование колбы.
3. Добавьте 10 мл RMPI 1640, содержащей 10% FBS до sсверху трипсинизации.
4. Перенести макрофагальной клеточной суспензии из колбы в 50 мл полипропиленовую пробирку, центрифуга 300 мкг в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
5. Аккуратно ресуспендирования макрофаги в 1 мл полной среды.
6. Смешайте 10 мкл макрофагальной клеточной суспензии с 10 мкл раствора трипанового синего и определяют количество клеток макрофагальной и жизнеспособность (обычно> 95%) с помощью гемоцитометра.
7. На основе числа клеток (обычно около 15 - 18 х 10 ⁵ макрофаги), добавить дополнительную полную среду для достижения желаемой плотности высева клеток. Примечание: 1 х 10 ⁵ макрофаги в 1,5 мл среды на лунку 12-луночного планшета , будет производить около-сливающийся культуры.
8. После засева, инкубировать макрофаги в течение ночи в 37 ° C для культивирования клеток инкубаторе с 5% CO _2/95% воздуха , чтобы позволить прикрепление клеток. Затем начинают требующихся экспериментов.

Результаты

Жизнеспособность свежих или криосохранены моноцитов было больше , чем 95% , как определено с окрашивания трипановым синим ^9. На рисунке 1 и 2 сравнить при более низких и более высоких увеличениях, соответственно, прогресс свежих ...

Обсуждение

Создание определенных типов макрофаги могут прояснить некоторые противоречивые результаты, полученные исследователями при изучении биологии макрофагами. Использование различных условий культивирования и дифференциации факторов для формирования первичных макрофагах человека мож...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate