Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

Résumé

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Résumé

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Introduction

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

Protocole

La cytaphérèse a été réalisée dans le cadre du protocole de recherche d'un sujet humain approuvé par un National Institutes of Health Institutional Review Board.

1. Isolement et Cryoconservation des monocytes

1. Obtenir des cellules mononucléaires par cytaphérèse de donneurs humains, et d' enrichir les monocytes par contre-courant continu élutriation de centrifugation des cellules mononucléaires telles que décrites dans les références ^7,8. Obtenir environ 100 x 10 ⁶ cellules décanté (environ 80 - 90% de monocytes) dans un tampon d'élutriation spécifié par le fabricant. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
2. monocytes centrifuger dans un tube de 15 ml de polypropylène à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
3. Eliminer le surnageant et remettre en suspension doucement les cellules dans du FBS suivi par le sulfoxyde de diméthyle pour obtenir une concentration finale de 90% de FBS / 10% de diméthylsulfoxyde et 50 x 10 ⁶ cellules / ml.
4. Ajouter chaque ml de suspension cellulaire to un cryovial individuel.
5. Placer les cryotubes dans un récipient de congélation de cellules et les transférer vers un congélateur à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer vers un réservoir de stockage d'azote liquide cryofiole pour le stockage à long terme.

2. Différenciation de monocytes en Macrophages

1. Décongeler un cryotube de cellules en transférant rapidement dans un bain-marie à 37 ° C, puis immédiatement après l'élimination de la suspension cellulaire a décongelé environ 70%.
2. Immédiatement après décongélation complète à la température ambiante, transférer les 1 ml contenus cryovial dans 50 ml de 37 ° C réchauffé Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyenne avec 2 mM de L-glutamine, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleukine-10 (IL-10) et 10% de FBS (milieu complet).
3. Prélever 25 ml de suspension de monocyte dans chacun de deux flacons de 75 ^cm2 de culture cellulaire en plastique.
4. Incuber les cultures à 37 ° C , une culture cellulaire incubateur avec 5% de _CO2 / 95% d' air pendant 48 heures.
5. Rincer la cultures 3 fois avec 10 ml de milieu RPMI 1640 (préchauffée à 37 ° C), en éliminant doucement le milieu de culture afin d'éviter de déloger toutes les cellules faiblement fixées.
6. Après rinçage, ajouter un milieu complet frais, changeant moyenne tous les 2 jours jusqu'à ce que les monocytes se différencient et prolifèrent suffisamment pour devenir confluentes. Ce qui nécessite environ une semaine de culture.

3. Récolte Macrophages pour lancer des expériences

1. Rincer les macrophages différenciés dans un ballon 3 fois avec 10 ml de pré-chauffé à tampon phosphate une solution saline de 37 ° C Dulbecco sans Ca2 ⁺ et Mg2 ⁺ avant d' ajouter 10 ml préchauffée acide trypsine éthylènediaminetétraacétique (EDTA) , solution à 37 ° C de 0,25%.
2. Placer dans fiole de culture cellulaire incubateur pendant 10 - 15 min, à laquelle environ 90% des macrophages aurait arrondi et détaché. Vérifiez ceci par un examen microscopique du flacon.
3. Ajouter 10 ml de RPMI 1640 contenant 10% de FBS à stop trypsinisation.
4. Transférer la suspension cellulaire macrophage de la fiole dans un tube de polypropylene de 50 ml, centrifuger 300 g pendant 5 min, et jeter le surnageant.
5. Resuspendre doucement les macrophages dans 1 ml de milieu complet.
6. Mélanger 10 ul de suspension cellulaire avec 10 ul macrophage solution bleu Trypan et déterminer le nombre de cellules et la viabilité de macrophage (typiquement> 95%) en utilisant un hémocytomètre.
7. Sur la base du comptage des cellules (habituellement environ 15 - 18 x 10 ⁵ macrophages), ajouter un milieu complet supplémentaire pour atteindre la densité cellulaire d'ensemencement souhaitée. Note: 1 x 10 ⁵ macrophages dans 1,5 ml de milieu par puits d'une plaque de 12 puits produira une culture quasi-confluentes.
8. À la suite de l' ensemencement, les macrophages incuber pendant une nuit dans une culture de cellules C incubateur à 37 ° avec 5% de _CO2 / 95% d' air pour permettre la fixation des cellules. Ensuite, commencer les expériences souhaitées.

Résultats

La viabilité des monocytes frais ou cryoconservés est supérieure à 95% telle que déterminée par coloration au bleu Trypan ^9. La figure 1 et la figure 2 compare à des grossissements inférieurs et supérieurs, respectivement, la progression de la différenciation des monocytes frais et cryoconservés ( par exemple, congelé) dans les macrophages. Notez que les frais comparé à monocytes cryoconservés montrent ...

Discussion

Génération types de macrophage définis peut clarifier certains des résultats contradictoires obtenus par les enquêteurs lors de l'étude de la biologie macrophage. L'utilisation de différentes conditions de culture et des facteurs de différenciation pour générer des macrophages humains primaires peuvent conduire à des types très différents macrophage, un fait qui ne peut être apprécié par le chercheur. Par exemple, les macrophages sont parfois produites à partir de monocytes humains en utilisant ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate