Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Özet

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Özet

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Giriş

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

Protokol

Lökoferez Sağlık kurumsal inceleme kurulu Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmış bir insan öznenin araştırma protokol kapsamında gerçekleştirildi.

1. İzolasyon ve Monositler Kryoprezervasyon

1. İnsan donörlerin lökaferez tarafından mononükleer hücreleri elde, ve referanslar ^7,8 açıklandığı gibi mononükleer hücrelerin sürekli karşı akım santrifüj elutrasyonun tarafından monositler zenginleştirmek. Üretici tarafından belirtilen sivili ayrıştırma tamponunda - (% 90 monositler yaklaşık 80) yaklaşık 100 x 10 ⁶ elutriated hücre elde. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
2. 300 xg'de 15 mi polipropilen tüp içinde santrifüj monositler Oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı.
3. Bir son% 90 FBS /% 10 dimetil sülfoksit konsantrasyonu 50 x 10 ⁶ hücre / ml elde etmek için, dimetil sülfoksit, ardından FBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe Süpernatantı ve.
4. Hücre süspansiyonu t her ml ekleyinbağımsız bir cryovial O.
5. Hücre dondurma kapta cryovials yerleştir ve transfer -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya 24 saat boyunca, uzun süreli depolama için bir sıvı azot depolama tankı cryovial aktarmadan önce.

Makrofajlar içine Monositler 2. Farklılaşma

1. hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosuna transfer ve hücre süspansiyonu yaklaşık% 70 çözülmüş zaman derhal kaldırarak hücre cryovial çözülme.
2. Hemen, oda sıcaklığında komple erime üzerine Cı Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml 1640 ortamı ısıtıldı, 37 °, 50 ml 1 ml cryovial içeriğini aktarmak interlökin-10 (IL-10) ve% 10 FBS (tam ortam).
3. Aktarım, iki 75 cm ² Plastik hücre kültürü şişesinden her birine monosit süspansiyonu 25 mi.
4. 48 saat boyunca% 5 _CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü inkübatöründe kültürleri inkübe edin.
5. cu durulayınRPMI 1640 ortamı yavaşça bir gevşek bağlı hücrelerin yerini değiştirmemek için, kültür ortamının çıkarılması, (37 ° C önceden ısıtılmış) mi, 10 ile ltures 3 kez.
6. durulama sonrasında, monositler ayırt kadar ortam her 2 günde bir değişen, taze tamamlanmış besiyeri ekleyebilir ve konfluent hale gelmeye yeterli çoğalır. Bu kültürün yaklaşık bir hafta gerektirir.

3. Hasat Makrofajlar Deneyler Başlatacak

1. 10 ml bir şişe içinde 3 kez ayırt makrofajlar durulayın önceden ısıtılmış 37 ° C,% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 10 ml ilave edilmeden önce ^{2 +} ve Mg2 ^+, Ca olmayan 37 ° C Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su önceden ısıtılmış.
2. makrofajlar yaklaşık% 90'ı yuvarlak ve müstakil olması gereken zaman 15 dakika - 10 hücre kültürü inkübatör Yeri balon. Şişenin mikroskopik inceleme ile bu doğrulayın.
3. % 10 FBS içeren RMPI 1640 ortamında 10 ml ŞÜst trypsinization.
4. 5 dakika boyunca santrifüj 50 ml polipropilen tüpe şişeye 300 xg makrofaj hücre süspansiyonu aktarın ve süpernatant atılır.
5. Yavaşça tam ortam içinde 1 ml makrofajlar yeniden süspanse edin.
6. 10 ul Tripan Mavisi solüsyonu ile makrofaj hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın ve bir hemositometre kullanılarak makrofaj hücre sayısı ve canlılığı (tipik olarak>% 95) belirler.
7. Hücre sayımına bağlı olarak (genel olarak yaklaşık 15-18 x 10 ⁵ makrofajlar), arzu edilen tohumlama hücre yoğunluğu elde etmek için ek bir tam orta ekleyin. Not: 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için 1.5 ml ortam içinde 1 x 10 ⁵ makrofajlar yakın bir Birleşik kültür üretecektir.
8. Tohumlamadan sonra, hücre tutunmasını sağlar,% 5 _CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü gece boyunca inkübatör içinde makrofajlar inkübe edin. Sonra, istenen deneyleri başlar.

Sonuçlar

Tripan mavi ⁹ boyama ile saptandığı haliyle, taze veya dondurulmuş monosit canlılığı Şekil 1.% 95'den daha fazla olan ve Şekil 2, alt ve üst büyütmelerde karşılaştırabilir sırasıyla makrofajlara taze ve dondurularak saklanmış (yani, donmuş) monosit farklılaşmasının ilerlemesi. Kriyoprezerve monositler yaymak ancak yuvarlak kalmaz monositler ayırt gösteren bir alt göstermektedir taze ka...

Tartışmalar

tanımlı makrofaj türlerini üreten makrofaj biyoloji okuyan zaman araştırmacılar tarafından elde edilen çelişkili sonuçların bazılarını şöyle açıklamak mümkündür. çeşitli kültür koşulları ve farklılaşma faktörleri kullanımı primer insan makrofaj farklı makrofaj türlerine neden olabilir araştırmacı tarafından takdir olabilir bir gerçeği üretir. Örneğin, makrofajlar bazen serum tek başına insan serumu, FBS başına M-CSF, ya da M-CSF veya GM-CSF ihtiva eden FBS ile takviye edil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate