대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

요약

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

초록

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

서문

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

프로토콜

백혈구 성분 채집은 보건 기관 검토위원회의 국립 연구소의 승인을 인간 대상의 연구 프로토콜에 따라 수행 하였다.

1. 분리 및 단핵구의 냉동 보존

1. 인간의 기증자의 백혈구 성분 채집하여 단핵 세포를 확보하고, 참고 문헌 ^7,8에 설명 된대로 단핵 세포의 연속 역류 원심 분리 세광에 의해 단핵구을 풍부. 제조자가 지정한 세광 버퍼 - (90 % 단핵구 약 80) 약 100 × ¹⁰⁶ 씻겨져 걸러진 세포를 얻습니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
2. 300 XG에 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 원심 분리기 단핵구 실온에서 5 분간.
3. 최종 90 % FBS / 10 % 디메틸 술폭 시드 농도 50 × ¹⁰⁶ 세포 / ml를 달성하는 디메틸 술폭 시드 이어 FBS에서 세포를 재현 탁 조심스럽게 상층 액을 제거하고.
4. 세포 현탁액의 t의 각 ML을 추가개인 cryovial을 오.
5. 셀 냉동 컨테이너에 배치 크리오 바이알 (cryovial)로 전송하고 -80 ° C의 냉동고에 24 시간 동안의 장기 저장을 위해 액체 질소 cryovial 저장 탱크로 전환하기 전에.

대 식세포에 단핵구 2. 차별화

1. 빠르게 37 ℃의 수조에 전달하고, 세포 현탁액은 약 70 % 융해되었을 때 즉시 제거하여 세포를 해동 cryovial.
2. 즉시 실온에서 완전 해동시에 C가 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 2 mM L- 글루타민, 50 NG / ㎖ M-CSF, 25 ng의 / ㎖와 1640 가온 37 50 ㎖로 한 용액을 cryovial 내용을 전송 인터루킨 10 (IL-10) 및 10 % FBS (완전 배지).
3. 전송이 ^75cm이 플라스틱 세포 배양 플라스크 각각에 단구 현탁액 25 ㎖.
4. 48 시간 동안 5 % CO _{95분의 2} %의 공기와 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 배양 물을 인큐베이션.
5. CU를 씻어RPMI 1640 배지를 부드럽게 느슨하게 붙어있는 세포를 빠지 않도록 배지를 제거하고 (37 ℃로 미리 가온) 10 mL로 3 회 ltures.
6. 세정 후, 단핵 세포가 분화 될 때까지 중간마다 이일을 변경, 신선한 완전 배지를 추가 합류가 충분히 증식. 이것은 문화의 약 1 주일이 필요합니다.

3. 수확 식세포는 실험을 시작합니다

1. 10 ㎖의 플라스크에 3 회 분화 된 대 식세포 린스 예열 37 ° C, 0.25 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 10 ㎖를 첨가하기 전에 ^{2 +} Mg를 ^{칼슘 2} 않고 37 ° C 둘 베코 인산염 완충 식염수를 예열.
2. 대 식세포의 약 90 %가 반올림과 분리해야하는 시간에 15 분 - 10 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크. 플라스크의 현미경 검사하여이를 확인합니다.
3. 10 % FBS를 포함 RMPI 1640 배지 10 ㎖의에 추가상단 트립신.
4. 5 분 동안 원심 분리기, 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 플라스크에서 300 XG를 대식 세포 현탁액을 전송하고, 상층 액을 버린다.
5. 부드럽게 완전 배지 1 ㎖에 재현 탁 식세포.
6. 10 ㎕의 트리 판 블루 용액으로 대식 세포 현탁액 10 μL를 혼합하고 혈구를 사용 대식 세포 수 및 생존율 (전형적으로> 95 %)를 결정한다.
7. 셀 수에 기초하여 (일반적으로 약 15-18 × ¹⁰⁵ 식세포) 원하는 시딩 세포 밀도를 달성하기 위해 추가적인 완전 배지를 추가한다. 참고 : 12 웰 플레이트의 웰 당 1.5 ml의 배지에서 1 × 10 ⁵ 대 식세포를 거의 합류 문화를 생성합니다.
8. 접종 후, 세포 부착을 허용하기 위해 5 % CO _{95분의 2} %의 공기와 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양 한 대 식세포. 그런 다음, 원하는 실험을 시작한다.

결과

트리 판 블루 ⁽⁹⁾ 염색으로 결정 신선 또는 냉동 보존 단핵 세포의 생존 도표 1. 95 % 이상이고 그림 2는 낮은과 높은 배율에서 비교, 각각 식세포에 신선하고 냉동 보관 (즉, 냉동) 단핵구의 분화의 진행. 냉동 보관 단핵구 확산하지만 반올림 남아 있지 않습니다 단핵 세포를 분화의 모집단을 보여와 신선한 비교합니다. 상...

토론

정의 식세포 유형을 생성하는 대 식세포 생물학을 연구 할 때 조사자에 의해 얻어진 결과가 충돌의 일부를 명확하게 할 수있다. 다양한 배양 조건 및 분화 인자의 사용은 차 인간 대 식세포는 아주 다른 식세포 타입을 초래할 수 연구자에 의해 인식되지 않을 수있는 점을 생성한다. 예를 들어, 대 식세포는 때때로 어떤 혈청, 인간 혈청 형, FBS 만 M-CSF, 또는 M-CSF 또는 GM-CSF를 함유 FBS 보충 된 인간 혈...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate