Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Zusammenfassung

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Zusammenfassung

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Einleitung

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

Protokoll

Leukapherese wurde unter einem menschlichen Subjekt Forschungsprotokoll, das von einem National Institutes of Health Institutional Review Board genehmigt durchgeführt.

1. Isolierung und Kryokonservierung von Monozyten

1. Erhalten einkernigen Zellen durch Leukapherese von menschlichen Spendern und bereichern Monozyten durch kontinuierliche Gegenstrom - Zentrifugation Auswaschung von einkernigen Zellen als ^7,8 in den Referenzen beschrieben. Erhalten ca. 100 x 10 ⁶ aufgeschlämmt Zellen (etwa 80 bis 90% Monozyten) in Elutriation Puffer vom Hersteller angegeben. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
2. Zentrifuge Monozyten in einem 15 ml Polypropylen-Röhrchen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen vorsichtig in FBS resuspendieren von Dimethylsulfoxid , gefolgt in einer Endkonzentration von 90% FBS / 10% Dimethylsulfoxid zu erreichen , und 50 x 10 ⁶ Zellen / ml.
4. In jeder ml der Zellsuspension to eine individuelle Cryovial.
5. Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einer Zelle Gefrierbehälter und in einen -80 ° C Gefrierschrank für 24 h vor Kryoröhrchen Vorratsbehälter für die Langzeitlagerung zu einem flüssigen Stickstoff übertragen.

2. Differenzierung von Monozyten in Makrophagen

1. Auftauen ein Kryoröhrchen von Zellen durch zu einem 37 ° C Wasserbad schnell übertragen und dann sofort zu entfernen, wenn die Zellsuspension etwa 70% aufgetaut ist.
2. Unmittelbar nach dem vollständigen Auftauen bei Raumtemperatur, übertragen Sie die 1 ml Kryoröhrchen Inhalt in 50 ml 37 ° C erwärmt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml Interleukin-10 (IL-10) und 10% FBS (komplettes Medium).
3. Transfer 25 ml Monozyten - Suspension in jeweils zwei 75 cm ² Plastikzellkulturflaschen.
4. Inkubieren Kulturen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO _2/95% Luft für 48 Stunden.
5. Spülen Sie die cultures 3 mal mit 10 ml RPMI 1640-Medium (vorgewärmt auf 37 ° C), sanft das Kulturmedium Entfernen jeglicher lose anhaftenden Zellen zu vermeiden Verdrängen.
6. Nach dem Spülen, fügen Sie frisches komplettes Medium, Mediumwechsel alle 2 Tage bis Monozyten differenzieren und ausreichend zu konfluieren vermehren. Dies erfordert etwa eine Woche der Kultur.

3. Ernte Makrophagen Experimente zu initiieren

1. Spülen differenzierten Makrophagen in Kolben 3 mal mit 10 ml vorgewärmten 37 ° C Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ohne Ca ²⁺ und Mg ²⁺ , bevor die Zugabe von 10 ml vorgewärmten 37 ° C 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung.
2. Danach wird der Kolben in der Zellkultur-Inkubator 10 - 15 min zu diesem Zeitpunkt etwa 90% der Makrophagen abzurunden und abgelöst. Überprüfen dies durch mikroskopische Untersuchung des Kolbens.
3. 10 ml RMPI 1640-Medium mit 10% FBS zu sTop Trypsinierung.
4. Übertragen Sie die Makrophagen-Zellsuspension aus dem Kolben in ein 50 ml Polypropylenröhrchen, Zentrifuge 300 xg für 5 min, und den Überstand verwerfen.
5. resuspendieren Sie vorsichtig die Makrophagen in 1 ml Vollmedium.
6. Mischen 10 ul Makrophagenzellsuspension mit 10 ul Trypanblau-Lösung und bestimmen Makrophagenzellzahl und Lebensfähigkeit (typischerweise> 95%) unter Verwendung eines Hämozytometers.
7. Auf der Grundlage der Zellzahl ( in der Regel etwa 15 - 18 x 10 ⁵ Makrophagen), fügen Sie zusätzliche Komplettmedium die gewünschte Seedingzelldichte zu erreichen. Anmerkung: 1 x 10 ⁵ Makrophagen in 1,5 ml Medium pro Well einer 12-Well - Platte wird eine nahezu konfluenten Kultur herzustellen.
8. Folgende Aussäen über Nacht inkubieren Makrophagen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO _2/95% Luft Zellanheftung zu ermöglichen. Dann beginnen die gewünschten Experimente.

Ergebnisse

Die Lebensfähigkeit von frischen oder kryokonserviert Monozyten war größer als 95% , wie mit bestimmt Trypanblau ⁹ Färbung. Abbildung 1 und Abbildung 2 vergleichen bei niedrigeren und höheren Vergrößerungen bzw. der Fortschritt der frischen und kryokonservierten (dh gefroren) Monozytendifferenzierung in Makrophagen. Beachten Sie, dass die frisch im Vergleich mit kryokonservierten Monozyten eine Subpopulation de...

Diskussion

definiert Makrophagen-Typen generieren können von den Forschern erhalten einige der widersprüchlichen Ergebnisse verdeutlichen, wenn Makrophagen Biologie zu studieren. Die Verwendung von verschiedenen Kulturbedingungen und Differenzierungsfaktoren Makrophagen primären humanen erzeugen eine Tatsache zu sehr unterschiedlichen Makrophagen-Typen führen kann, die nicht durch den Forscher schätzen. Zum Beispiel werden manchmal Makrophagen aus humanen Monozyten erzeugt allein kein Serum, menschlichem Serum unter Verwendun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate