マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

要約

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

要約

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

概要

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

プロトコル

白血球搬出は、保健機関審査委員会の国立研究所によって承認されたヒト被験体の研究プロトコルの下で行いました。

1.単離と単球の凍結保存

1. 人間のドナーの白血球搬出によって単核細胞を得る、および参考文献^7,8に記載されているように、単核細胞の連続向流遠心水簸によって単球を豊かにします。製造業者が指定する水簸バッファに- （90％単球約80）約100×10 ⁶簸細胞を得ます。血球計数器を用いて細胞を数えます。
2. 300×gで15ミリリットルポリプロピレンチューブで遠心分離した単球 室温で5分間。
3. 上清を除去し、穏やかに90％FBS / 10％ジメチルスルホキシド、50×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度を達成するようにジメチルスルホキシド、続いFBSで細胞を再懸濁します。
4. 細胞懸濁液tの各ミリリットルを加えます個々のクライオバイアルO。
5. セル冷凍コンテナ内のクライオバイアルを置き、に転送-80℃のフリーザー24時間長期保存のために液体窒素クライオバイアル貯蔵タンクに移す前に。

単球からマクロファージへの2分化

1. すぐに37℃の水浴に移し、細胞懸濁液は、約70％を解凍したときにすぐに除去することによって細胞のクライ​​オバイアルを解凍します。
2. すぐに室温で完全に融解時、37の50ミリリットルに1ミリリットルをクライオバイアル内容を転送°Cは、2 mMのL-グルタミン、50 ngの/ mlのM-CSF、25 ngの/ mlのロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地を温めインターロイキン10（IL-10）、及び10％FBS（完全培地）。
3. 移送2 75cm ²のプラスチック製の細胞培養フラスコのそれぞれへの単球の懸濁液を25ml。
4. 48時間、5％CO _2/95％空気で37℃で細胞培養インキュベーター中で培養物をインキュベートします。
5. 立方をすすぎますRPMI 1640培地を穏やかに任意の緩く付着した細胞を取り除く回避するために、培養培地を除去し、（37℃に予め温めておいた）mlの10でltures 3回。
6. 単球が分化し、コンフルエントになるまで十分に増殖するまで2日毎に培地を交換し、新鮮な完全培地を追加し、すすぎに続いて。これは文化の約1週間が必要です。

3.収穫マクロファージ実験を開始します

1. 10mlのフラスコ中で3回分化マクロファージリンス予め温めた37℃の0.25％トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液10 mlで添加する前に、Ca ²⁺及びMg ^{2+ を}含まない37℃のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を予熱しました。
2. マクロファージの約90％は四捨五入と切り離されている必要があり、その時点で15分 - 10のための細胞培養インキュベーターにフラスコを置きます。フラスコの顕微鏡検査することによってこれを確認してください。
3. 10％FBSを含むRMPI 1640培地10 mlのSへの追加トップトリプシン処理。
4. 5分間の遠心分離器、50ミリリットルのポリプロピレンチューブにフラスコから300×gでのマクロファージ細胞懸濁液を移し、上清を捨てます。
5. 静かに完全培地の1ミリリットル中にマクロファージを再懸濁します。
6. 10μlのトリパンブルー溶液を用いてマクロファージ細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を使用して、マクロファージ細胞数および生存率（典型的には> 95％）を決定します。
7. 細胞数に基づいて、（通常は約15から18×10 ⁵マクロファージ）、目的の播種細胞密度を達成するために追加の完全培地を追加します。注：12ウェルプレートのウェル当たり1.5ミリリットル培地中で1×10 ⁵マクロファージを、近コンフルエント文化を生成します。
8. 播種後、細胞の付着を可能にするために、5％CO _2/95％空気で37℃で細胞培養インキュベーターで一晩マクロファージインキュベートします。次に、目的の実験を開始します。

結果

トリパンブルー染色⁹で決定されるような新鮮または凍結保存した単球の生存率は95％以上であった。 図 1および図2は 、それぞれ、より低いおよびより高い倍率でマクロファージへ新鮮で凍結保存した（ すなわち 、冷凍）単球分化の進行状況を比較します。凍結保存した単球と比較して、新鮮なが広がっていない?...

ディスカッション

定義されたマクロファージの種類を生成することは、マクロファージの生物学を研究する研究者によって得られた相反する結果のいくつかを明確にすることができます。初代ヒトマクロファージを生成するために、さまざまな培養条件および分化因子の使用は、非常に異なるマクロファージタイプに研究者によって理解されなくてもよいことを導くことができます。例えば、マクロファージ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate