תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

Summary

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Abstract

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Introduction

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

Protocol

Leukapheresis בוצע תחת פרוטוקול המחקר של הסובייקט אנושי שאושר בידי מכוני הלאומיים לוח סקירה מוסדית הבריאות.

1. ניתוק ו Cryopreservation של מונוציטים

1. להשיג תאים mononuclear ידי leukapheresis התורמים אדם, ולהעשיר מונוציטים ידי elutriation צנטריפוגה רציפה נגד זרימה של תאים mononuclear כמתואר אזכור ^7,8. השג כ 100 x 10 ⁶ תאים elutriated (כ -80 - 90 מונוציטים%) במאגר elutriation שצוינו על ידי היצרן. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
2. מונוציטים צנטריפוגה בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר את supernatant בעדינות resuspend התאים FBS ואחריו sulfoxide דימתיל כדי להשיג ריכוז סופי של sulfoxide דימתיל 90% FBS / 10% ו -50 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
4. הוסף כל מ"ל של התא תלוי על העריסהo cryovial הפרט.
5. מניחים את cryovials במיכל הקפאה תא ולהעביר מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת טנק אחסון cryovial חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

בידול 2. של מונוציטים לתוך המקרופאגים

1. פשרת cryovial של תאים על ידי העברה במהירות באמבט מי 37 ° C ומייד הסרה כאשר השעית התא הפשירה כ -70%.
2. מיד עם ההפשרה מלאה בטמפרטורת החדר, להעביר את 1 מ"ל תוכנו cryovial לתוך 50 מ"ל של 37 ° C חימם רוזוול פארק הזיכרון במכון (RPMI) 1640 בינוני עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukin-10 (IL-10), ו -10% FBS (בינוני מלא).
3. העברת 25 מ"ל של השעיה מונוציטים לתוך כל אחת משתי 75 ס"מ ² צלוחיות תרבית תאים פלסטיק.
4. דגירת תרבויות בתוך חממת תרבית תאי 37 ° C עם אוויר 5% CO _2/95% למשך 48 שעות.
5. שוטפים את מ"קltures 3 פעמים עם 10 מיליליטר RPMI 1640 בינוניים (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), הסרת בינוני התרבות בעדינות כדי למנוע פירוק כל תאים מחוברים באופן רופף.
6. בעקבות שטיפה, להוסיף בינוני שלם טרי, שינוי בינוני כל 2 ימים עד מונוציטים להבדיל מתרבים מספיק להיות ומחוברות. זה דורש כשבוע של התרבות.

המקרופאגים קציר 3. ליזום ניסויים

1. לשטוף מקרופאגים הבדיל ב הבקבוק 3 פעמים עם 10 מ"ל מראש חימם 37 ° שנאגרו מלוחים פוספט של C Dulbecco ללא Ca ^{2 +} ו Mg ²⁺ לפני הוספת 10 מ"ל מראש חימם 37 ° C 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה פתרון (EDTA).
2. מקום בקבוק באינקובטור תרבית תאים עבור 10 - 15 דקות שאז כ 90% של מקרופאגים צריכים מעוגלים ומנותקות. לבדוק זאת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של הבקבוק.
3. הוסף 10 מ"ל של מדיום RMPI 1640 המכיל 10% FBS כדי strypsinization העליון.
4. מעבירים את ההשעיה תא מקרופאג מהבקבוק לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל, צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות, וזורקים supernatant.
5. Resuspend בעדינות את מקרופאגים לתוך 1 מ"ל של מדיום מלאה.
6. מערבבים 10 μl של השעיה תא מקרופאג עם 10 μl פתרון Trypan כחול לקבוע מספר הסלולרי מקרופאג הכדאיות (בדרך כלל> 95%) באמצעות hemocytometer.
7. בהתבסס על ספירת התאים (בדרך כלל בערך 15 - 18 x 10 ⁵ מקרופאגים), להוסיף בינוני מלא נוסף כדי להשיג את צפיפות תאי זריעה הרצויה. הערה: 1 x 10 ⁵ מקרופאגים 1.5 מ"ל בינוני לכל גם צלחת 12 גם יפיק התרבות ליד ומחוברות.
8. בעקבות זריעה, דגירת מקרופאגים לילה חממת תרבית תאי 37 ° C עם 5% CO _2/95% אוויר לאפשר התקשרות תא. לאחר מכן, מתחיל ניסויים רצויים.

תוצאות

הכדאיות של מונוציטים טריים או cryopreserved היה יותר מ -95% כפי שנקבע עם Trypan כחול מכתים ^9. איור 1 ואיור 2 להשוות בבית התחתון בהגדלות גדולות, בהתאמה, את ההתקדמות של בידול מונוציטים טריים cryopreserved (כלומר, קפוא) לתוך מקרופאגים....

Discussion

יצירת סוגים מקרופאג מוגדר יכול להבהיר כמה תוצאות סותרות שהגיעו לידי החוקרים כאשר לומדים ביולוגיה מקרופאג. שימוש תנאי תרבות שונים וגורם בידול כדי ליצור מקרופאגים אדם מן המעלה ראשון יכולים להוביל סוגי מקרופאג שונים מאוד, עובדה כי לא יכול להיות מוערכת על ידי החוקר. לדו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate