La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

Resumen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Resumen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

Introducción

Study of cultured macrophages is a useful model to understand the function of these cells in inflammation such as occurs in atherosclerotic plaques. When the research focus is on human diseases involving macrophages, it is useful to study primary human macrophages rather than non-human macrophages to avoid species differences. Also, the effects of cell transformation can be avoided by using primary macrophages rather than macrophage cell lines. For this purpose, macrophages differentiated from monocytes isolated from human blood serve as a means of obtaining primary human macrophages.

Tissue macrophages may be either resident within tissues or may be derived from monocytes that migrate into the tissue and differentiate into macrophages ¹. Two types of human monocyte-derived macrophages have been defined that differ not only in morphology but also gene expression and cell function ². These two types are obtained from monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of M-CSF + fetal bovine serum (FBS) and monocytes that are differentiated into macrophages in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + FBS ^2-6. In our experience (unpublished observation), use of human serum rather than FBS generates the GM-CSF type regardless of whether M-CSF or GM-CSF is included in the differentiation medium. M-CSF type macrophages tend to be more elongated than GM-CSF type macrophages, which resemble fried eggs in their morphology. Investigators should recognize that human M-CSF and GM-CSF monocyte-derived macrophages are not the same as so called M1 and M2 mouse bone marrow-derived macrophages ⁶.

During research using human monocyte-derived M-CSF differentiated macrophages, we experienced difficulty related to the availability of monocytes to initiate experiments and variation in the obtained cell densities of macrophages during differentiation of monocytes into macrophages. To overcome these problems, we have developed the following protocol in which monocytes are frozen until required for use, and monocytes are differentiated in bulk into macrophages that can then be removed from culture flasks and plated at desired cell densities to obtain more uniform cultures from experiment to experiment.

Protocolo

Leucoféresis se llevó a cabo bajo el protocolo de investigación de un sujeto humano aprobado por los Institutos Nacionales de Salud junta de revisión institucional.

1. Aislamiento y la criopreservación de los monocitos

1. Obtener células mononucleares por leucoféresis de donantes humanos, y enriquecer los monocitos por centrifugación de contracorriente continua de elutriación de las células mononucleares tal como se describe en las referencias ^7,8. Obtener aproximadamente 100 x 10 ⁶ células elutriated (aproximadamente 80 - 90% monocitos) en tampón de elutriación especificado por el fabricante. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
2. monocitos de centrífuga en un tubo de polipropileno de 15 ml a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células suavemente en FBS seguido de sulfóxido de dimetilo para lograr una concentración final de 90% de FBS / 10% de dimetilsulfóxido y 50 x 10 ⁶ células / ml.
4. Añadir cada ml de suspensión de células to un criovial individual.
5. Coloque los crioviales en un recipiente de congelación de células y la transferencia a un congelador a -80ºC durante 24 horas antes de transferir a un tanque de almacenamiento criovial nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

2. La diferenciación de monocitos en macrófagos

1. Descongelar un criovial de las células mediante la transferencia rápidamente a un baño de agua C 37 ° y luego retirar inmediatamente cuando la suspensión de células se ha descongelado sobre 70%.
2. Inmediatamente después de la descongelación completa a temperatura ambiente, transferir 1 ml contenidos criovial en 50 ml de 37 ° C se calentó Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleucina-10 (IL-10), y 10% de FBS (medio completo).
3. 25 ml de la suspensión de monocitos en cada uno de dos 75 cm ² frascos de cultivo celular de plástico.
4. Incubar culturas en un 37 ° C incubadora de cultivo de células con 5% _{de CO2} / 95% de aire durante 48 hr.
5. Enjuague el cultures 3 veces con 10 ml de medio RPMI 1640 (pre-calentado a 37 ° C), eliminando suavemente el medio de cultivo para evitar que se desprenda cualquier célula poco adheridas.
6. Tras el aclarado, se añade medio completo fresco, el cambio de medio cada 2 días hasta que los monocitos se diferencian y proliferan suficientemente para convertirse en confluentes. Esto requiere aproximadamente una semana de cultivo.

3. Los macrófagos de cosecha para iniciar experimentos

1. Enjuague los macrófagos diferenciados en un matraz de 3 veces con 10 ml de pre-calentado solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 37 ° C sin Ca ²⁺ y Mg ²⁺ antes de añadir 10 ml de solución de pre-calentado (EDTA) 37 ° C 0,25% de ácido etilendiaminotetraacético tripsina.
2. Place matraz en una incubadora de cultivo celular durante 10 - 15 min, en cuyo momento aproximadamente 90% de los macrófagos debería haber redondeado y distante. Verificar esta por examen microscópico del matraz.
3. Añadir 10 ml de RPMI 1640 que contiene 10% de FBS a sla parte superior de la tripsinización.
4. Transferir la suspensión celular de macrófagos del matraz en un tubo de 50 ml de polipropileno, de centrifugación 300 xg durante 5 min, y descartar el sobrenadante.
5. resuspender suavemente los macrófagos en 1 ml de medio completo.
6. Mezclar 10 l de suspensión celular de macrófagos con 10 l solución de azul de tripano y determinar el número de células de macrófagos y la viabilidad (típicamente> 95%) utilizando un hemocitómetro.
7. Basado en el número de células (por lo general alrededor de 15 - 18 x 10 ⁵ macrófagos), añadir medio completo adicional para alcanzar la densidad celular de siembra deseada. Nota: 1 x 10 ⁵ macrófagos en 1,5 ml de medio por pocillo de una placa de 12 pocillos producirá una cultura casi confluentes.
8. Después de la siembra, incubar los macrófagos durante la noche en un 37 ° C incubadora de cultivo celular con 5% de aire _{de CO2} / 95% para permitir la unión celular. A continuación, iniciar los experimentos deseados.

Resultados

La viabilidad de los monocitos frescos o crioconservados era mayor que 95% según se determinó con azul de tripano tinción ^9. Figura 1 y la Figura 2 compara a aumentos inferiores y superiores, respectivamente, el progreso de frescos y criopreservados (es decir, congelada) diferenciación de los monocitos en macrófagos. Tenga en cuenta que la fresca en comparación con los monocitos criopreservados muestran una subp...

Discusión

La generación de los tipos definidos de macrófagos puede aclarar algunos de los resultados contradictorios obtenidos por los investigadores en el estudio de la biología de los macrófagos. El uso de varias condiciones de cultivo y los factores de diferenciación para generar los macrófagos humanos primarios pueden conducir a muy diferentes tipos de macrófagos, un hecho que no se puede apreciar por el investigador. Por ejemplo, los macrófagos a veces se generan a partir de monocitos humanos usando no suero, suero h...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellbind 12-well culture plate	Corning	3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated	Greiner Bio-One North America	658157
RPMI 1640 culture medium	Cellgro Mediatech	15-040-CM	warmed to 37 °C
L-Glutamine	Cellgro Mediatech	25-005-CI
Fetal bovine serum	Gibco	16000-036
M-CSF	PeproTech	300-25
GM-CSF	PeproTech	300-03
IL-10	PeproTech	200-10
DMSO	Sigma	D2650
Cryovial	Thermo Scientific	375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+	Corning cellgro	21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
50 ml polypropylene conical tube	Falcon	352070
Trypan Blue	Lonza	17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	610031	http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container	BioCision	BCS-405	other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1	Thermo Scientific	7400	any liquid nitrogen tank should be adequate