طريقة موثوقة لتقييم انبات البذور، الخمول، والوفيات تحت الظروف الحقلية

Summary

هنا نقدم بروتوكول لتقييم البقاء على قيد الحياة البذور، والإنبات والسكون تحت الظروف الحقلية باستخدام دفن، وشرائط البذور وصفت ونتروبلو كلوريد (TZ) اختبار قدرتها على البقاء.

Abstract

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Introduction

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو تقييم موثوق بقاء البذور مع مرور الوقت في ظل الظروف الميدانية.

بنوك البذور التربة هي محمية من تشتت والبذور بعد ungerminated قابلة للحياة توزيعها إما على سطح التربة، داخل القمامة السطح، أو داخل التربة، والتي قد تستمر عابر أو لسنوات عديدة ^1،2. عندما تم تطبيق طرق دفن البذور مماثلة لتلك التي عرضت هنا لدراسة استمرت لمدة 17 باستخدام عدة أنواع اثني عشر، تم العثور على بذور قابلة للحياة في العديد من الأنواع التي تم اختبارها ^3. بذور السكون هو كتلة لإنبات البذور حتى توليفة مناسبة من شروط الشتلات بقاء تنشأ ^4. يمكن أن تبقى نائمة سماح بذور البقاء على قيد الحياة ظروف قاسية، مثل انخفاض درجات الحرارة في فصل الشتاء والحد من المغذيات، أو الجفاف الموسمي، حتى محفز خارجي لالسكون الإفراج يسمح للإنبات. يطلق على السكون الإفراج يمكن أن تختلف من التعرض لمدد الباردة، والمركبات التي كتبها f اليسارغضب، أو الاعتداء الجسدي على معطف البذور من خلال الاحتكاك أو الاتصال مع أحماض المعدة الحيوان ^5. كما العظة إنبات يمكن أن يكون جنسا أو نوعا محددة، وغالبا ما تنجم عن الانتقاء الطبيعي الماضية، إنبات البذور غير القادرة على التأقلم هي تلك التي تحدث في وقت غير مناسب، ويمكن أن يؤدي في البذور أو الشتلات وفيات أو نمو البادرات الفقراء. في حين تم تصنيف السكون إلى عدد من أنواع على أساس آليات الإفراج السكون (على سبيل المثال، السكون الجسدي والسكون الفسيولوجي)، لا يزال ⁶ بذور الكمون واحدة من أقل يفهم المواضيع في بيولوجيا النبات. وهكذا، الدراسات الميدانية التي تسمح لتقييم وضع البذور أو مجموعات من البذور تحت الظروف البيئية ذات الصلة الفردية لها قوة تفسيرية أعلى من تلك التي تعتمد ببساطة على اختبارات الإنبات القياسية في المختبر.

استغلال خصائص البذور المعروفة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على آليات السكون. السيطرة على سكون البذور ويشتركmplex، بما في ذلك السيطرة الوراثية من العوامل الفسيولوجية والمورفولوجية. في حين أن الفهم الكامل لاتساع آليات السكون لم يتم بعد توضيح، برز النموذج العام، التي تنطوي على علاقة ردود الفعل بين اثنين من الهرمونات النباتية حمض الجبريليك (GA) وحمض الأبسيسيك (ABA) ^7. في هذا النموذج المعمم للبذور التي تحتوي على عنصر الفسيولوجية إلى السكون، وGA بمثابة إشارة لإطلاق السكون، في حين يخدم ABA للحفاظ على حالة سبات. التأثيرات الجينية الأمهات وكذلك بيئة النمو الأمهات يمكن أن تؤثر على السكون والصفات بذور أخرى، مثل الحجم، من خلال الأنسجة المولدة للأمهات وإشارات التنموية ^8. ولدت أمهات الهياكل الخارجية (أو أغطية البذور) قد حفاظ على السكون، وأحيانا في تركيبة مع منبهات الفسيولوجية. منذ يتم التحكم أغطية البذور المستمدة أمهات جينات (مورثات) نبات الأم، فإنها قد لا تعكس هذه البذور الفعلي النووي الوراثي الماكياج. لدينا لناإد وachenes دوار الشمس من مجموعة من الهجين المحاصيل البرية يعبر من استبعاد هذه التأثيرات الجينية مقابل الجنين الأمهات على خصائص البذور ^9،10. وهكذا، تصاميم الدراسة التي تشمل الأنواع المختلفة، وأنواع الصليب، أو المورثات يمكن استشفاف بعض المعلومات حول علم البيئة وعلم الوراثة من سكون البذور، الإنبات والبقاء على قيد الحياة.

مثالا هاما لكيفية إنبات البذور والبقاء على قيد الحياة الظواهر يمكن أن تؤثر على ديناميات السكان يمكن أن ينظر في المناطق المختلطة المحاصيل البرية. الاختيار خلال تدجين النباتات المزروعة يزيل معظم السكون، ويقلل من قدرة البذور على البقاء خارج موسم النمو. بعد تدفق الجينات، أو التهجين بين الأنواع المزروعة والبرية في المناطق المختلطة المحاصيل البرية يمكن إعادة العمل الأليلات المحاصيل (أو المتغيرات الجينية) إلى سكان البرية، مع الآثار المحتملة على ديناميات بنك البذور. الهجينة بين الأقارب المزروعة والبرية يحتمل أن تكون وجدت في المناطق المختلطة المحاصيل البرية قد تكون في حوزتهامجموعة متنوعة من الظواهر السكون المتوسطة، مع عدد قليل من الظواهر المتوقع أن البقاء في ظروف خارج القابلة للزراعة (على سبيل المثال، أشهر الشتاء) ^11.

والهدف من هذا المخطوط هو إظهار كيف، وذلك باستخدام البذور طريقة الشريط الدفن، نستطيع أن نقيم الإنبات، والسكون، والبقاء على قيد الحياة من مجموعة واسعة من أنواع البذور على فترات زمنية مختلفة لتحقيق الاختلاف الطبيعي في ظل الظروف الميدانية. في هذا المثال، قمنا بتوظيف بذور عباد الشمس من 15 أنواع هجينة عبر المحاصيل البرية منذ نحن مهتمون في التأثيرات الجينية للأم والجنين على خصائص البذور.

Protocol

1. جمع البذور من الأنواع متعددة أو الصلبان التحكم من نوع واحد

ملاحظة: هذا المثال استخدام البذور من 15 نوعا عبر داخل annuus هيليانثوث الأنواع (عباد الشمس) باستخدام البرية، والهجين، وأنواع المحاصيل مثل (انتاج البذور) الأم الأم.

1. في نهاية موسم النمو، وجمع رؤساء البذور الناضجة في أكياس المسمى. البذور النظيفة من القشر والبذور مكان في مظاريف وصفت مع الوالدين نوع الصليب في شكل موحد (أي س الأم الأب).
2. البذور السائبة معا في مظاريف كبيرة باستخدام كميات متساوية من بذور من عدد متساو من أنواع عبر الأبوية متطابقة. على سبيل المثال، 100 البذور من 10 أنواع تقاطع مع نفس الوالدين الأم والأب. تسمية المغلفات مع تحديد (عبر نوع) المعلومات. هذه المغلفات الكبيرة الماجستير البذور لاستخدامها في تعبئة شرائط الدفن في القسم 2.

	الوالد الأمهات
الوالد الأب	وايلد: WxW	F 1: WXC	المحصول: CXC
وايلد: WxW	0٪ WxW	25٪ F 1 XW †	50٪ CXW †
قبل الميلاد: WxF1 أو F1xW	12.5٪ WxBC	37.5٪ F 1 xBC	62.5٪ CxBC
F 1: WXC	25٪ WxF 1 †	50٪ F 1 XF 1	75٪ CXF 1 †
F 2: F 1 XF 1	25٪ WxF 2	50٪ F 1 XF 2	75٪ CXF 2
المحصول: CXC	50٪ WXC †	75٪ F 1 XC †	100٪ CXC

الجدول 1. الأبوية عبر رأنتجت ypes المنتجة من ناحية التلقيح. عباد الشمس أنواع هجينة عبر المحاصيل البرية مع اليد التلقيح لاستخدامها في التجربة دفن البذور. لجميع أنواع الصليب، والد الأم مدرجة الأول والد الأب سرد الثانية. أنواع عبر ملحوظ مع † هي جزء من المتبادلة أزواج نوع الصليب مع نفس الأليلات٪ المحاصيل ولكن الآباء الأمهات مختلفة. وقد تم نشر الجدول سابقا في: بيس، BA وآخرون. (2015) ^15.

2. إنشاء مخصص البذور شرائط الدفن

ملاحظة: على سبيل المثال، كان لدينا ثلاثة علاجات تاريخ الإزالة و 15 مكررات، لذلك نحن مطلوب 45 شرائح المجموع. يستخدم هذا المثال 15 مقصورات في قطاع لذا، المطلوب منا ما يكفي-مزجها غرامة ألياف البوليستر أو الناموسيات لإيواء 15، 7 × 10 سم المقصورات. انظر الشكل 1.

1. تبدأ بقطع الشريط 20 × 105 سم من القماش لكل قطاع البذور.
2. قياس وعلامة مقصورات، ثم اضعاف النسيج في نصف. باستخدام المهزومةح درجات الحرارة مسدس الغراء، ختم قصيرة (10 سم) نهاية واحدة. مرة يبرد الغراء قليلا، ولكن ليس تماما، اضغط على الجانبين النسيج معا لإنشاء ختم.
   تنبيه: ارتفاع درجة الحرارة الغراء والصمغ نصائح بندقية يمكن أن يسبب حروقا إذا ملامسة الجلد مددا.
3. خطوط الغراء من على حافة مطوية إلى نهاية قصيرة مفتوحة على كل علامة المقصورة. اضغط الجانبين النسيج معا على طول خطوط الغراء لضمان الأختام بدون ثقوب بين المقصورات. بذور المهاجرة بين المقصورات تساهم في الخطأ التجريبي.
   ملاحظة: الآن بعد أن المقصورات تم إنشاؤها، يجب أن تبقى على حافة تكشفت مفتوحة وعلى استعداد لاستقبال البذور وتحديد المعلومات الخاصة بهم (عبر نوع الاسم).
4. عشوائيا تعيين أنواع البذور عبر لمقصورات لكل قطاع.
   1. ملء مقصورات البذور مع عدد موحد من البذور (20 لكل حجرة تستخدم في هذا المثال). للتسميات، استخدم علامات دائمة الصناعية على قطع ليتأهل السهام حديقة البلاستيك بحيث تكون قادرة علىتحمل الدفن.
      ملاحظة: يمكن استخدام طرق وضع العلامات البديلة.
   2. بعد شغل في كل مقصورة مع البذور وتسميته، وختم مقصورة على الفور مع مسدس الغراء ارتفاع في درجة الحرارة. المضي قدما حتى يتم اغلاق قطاع البذور بأكمله تماما. تسمية قطاع العام في المقصورة الأولى مع تكرار، كتلة و / أو معالجة المعلومات.
      ملاحظة: للحصول على دراستنا، منذ كان لدينا إزالة الزمنية، وكتل، وتكرار شرائط داخل كتل، أدرجنا كل هذه المعلومات.
   3. تحقق من وجود فجوات بين المقصورات والغراء بقعة حسب الحاجة قبل الانتقال إلى قطاع المقبل.

الشكل 1. الدفن قطاع البذور التخطيطي. مثال على قطاع الدفن تبين تحديد نوع عبر عن المقصورات الفردية. يتم سرد الأم الأمهات الأول مع الوالد الأب المدرجة الثانية. وتشير الألوان النسب الأمهات مختلفة،مع الأصفر للالبرية، والأزرق للF ₁ الهجين، والأحمر للمحصول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. دفن أشرطة البذور في الميدان

1. حفر المؤامرات إلى عمق محدد إلى شرائح المنزل. تعيين شرائط لكتل ​​الفردية التي يتم ترتيب شرائط عشوائيا للسماح للتاريخ الإزالة لاستخدامها الحبكة الرئيسية والهوية مقصورة (في هذا المثال، عبر نوع) مثل حبكة فرعية في التحليل.
2. تغطية قطاع غزة مع الأرض. قطع معدنية الأجهزة شبكة القماش لتكون 10 سم أكبر من المؤامرات وعلى مدى شرائط دفن. استخدام U-دبابيس لتأمين حواف وحواف غطاء من القماش مع الأرض.
   ملاحظة: هذا هو غطاء لاستبعاد تختبئ الحيوانات المفترسة البذور. كخيار آخر، ميرسر وآخرون. ¹³ شيدت وصناديق من القماش الأجهزة التي تحيط شرائط البذور بسبب الضغط الشديد في غوفر المحلى مجال عملهم دفننشوئها.)
3. وضع الأعلام الملونة مساح على تمييز المكان الشريط وإزالة مواعيد لاستكمال سجلات مكتوبة واضحة.

4. حفر شرائط وتقييم البذور

1. حفر شرائط البذور المخصصة لتاريخ الإزالة معين. الحفاظ على الشرائط في بيئة رطبة باردة حتى تصل إلى المختبر حيث تقييم البذور ستجرى. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق لف الشرائط في صحيفة الرطب ووضعها في برودة النقل أو الشحن بين عشية وضحاها.
2. شطف الطين والتربة من الشرائط في الماء حتى شرائط نظيفة بما فيه الكفاية أن الحطام الخارجي سوف البذور لا غامضة.
3. استخدام مقص لقطع مفتوحة حجرة واحدة في وقت واحد. عدد البذور النابتة وإزالتها. عدد البذور الميتة بشكل واضح (على سبيل المثال، المتعفنة، أو بذور تحللت). وضع البذور ungerminated على المسمى، ورقة نشافة الرطب بيتري الحجم لزيادة تمييز بذور ungerminated، نائمة، والميتة.
   1. وضع أطباق بتري مع ungerminatedالبذور في مجموعة غرفة النمو للظروف إنبات القياسية: 25 درجة مئوية يوم / 10 ° C 12 ساعة / ليلة. تسمح بذور أسبوع واحد لتنبت. أي أن لا، عد هذه كما قابلة للحياة، ولكن ungerminated لأنها لا تنبت تحت الظروف الميدانية.
4. بعد العلاج غرفة النمو، واختبار ما تبقى البذور ungerminated لجدوى استخدام نتروبلو كلوريد (TZ) ^13. ولتحقيق ذلك، تشكل حلا في المئة من TZ يتناسب مع نوع الدراسة باستخدام دليل AOSA نتروبلو اختبار ^14. على سبيل المثال، يتم استخدام محلول 1٪.
   1. قطع بذور ungerminated في النصف ووضع نصف كان الجنين والسويداء مرئية في طبق بتري تحتوي على ما يكفي من حل TZ لتغطية البذور (بذور قد تطفو، وهذا على ما يرام).
   2. وضع أطباق بتري TZ إلى مجموعة حاضنة عند 30 درجة مئوية وانتظر 3 ساعات. ملاحظة: سيؤدي ارتفاع درجات الحرارة يؤدي إلى رد فعل أسرع، إذا رغبت في ذلك، ولكن overstaining خطر.
<لى> إزالة أطباق بتري من الحاضنة وتقييم. البذور التي الملون الأحمر في الأجنة هم germinable، بينما البذور غير ملوثين لقوا حتفهم. الرجوع إلى دليل اختبار نتروبلو AOSA لمزيد من التفاصيل عن حالات هامشية المميزة ونوع معين.

النتائج

أنواع تقاطع مع متنوعة نسبة النسب والمحاصيل أليل الأمهات (الجدول 1) اختلفت في مواعيد إزالة في المئة نبتت، ungerminated، والبذور ميت (الشكل 2 و 3). باستخدام اختبار TZ من البذور ungerminated، وجدنا بعض البذور نائمة حقا في إزالة الثانية (أوا?...

Discussion

نحن هنا نقدم طرق لاستخدام شرائط دفن البذور لمراقبة إنبات البذور، والسكون وفيات مخزون البذور المتنوعة في فترات زمنية المحددة مسبقا في هذا المجال. مزايا استخدام شرائط بدلا من الحزم الفردية تكمن في (1) سرعة قطاع البناء ومقصورة على الخلق من الحزم الفردية؛ و (2) سهولة وسرعة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small coin envelopes	Any
Large coin envelopes	Any
fine meshed polyester mosquito netting	Any
high-temperature glue gun	Any
high-temperature glue stick refills	Any
Industrial permenant markers	Any
plastic garden labels	Any
scissors	Any
Shovel	Any
Metal mesh hardward cloth	Any
Surveyor's flags, multiple colors	Any
Wet newspaper	Any
cooler	Any
blotter paper	Any
petri dishes	Any
Temp. controlled growth chamber	Any
razor blades	Any
Petri dishes	Any
Tetrazolium chloride	Any
water	Any
heat incubator	Any