الإجراءات الجراحية ومنهجية لنموذج الفئران قبل السريرية<em&gt; دي نوفو</em&gt; سرطان الثديي الانبثاث

Summary

نماذج ما قبل السريرية تقييم العلاج المساعد استهداف ورم خبيث سرطان الثدي تفتقر. لمعالجة هذا، قمنا بتطوير نموذج الفئران من دي نوفو الرئوي الانبثاث غدي الثديية، حيث العلاجات التي تدار في وضع مساعد (بعد استئصال الجراحي للأورام الأولية) يمكن تقييمها لفعالية في التأثير الانبثاث الرئوي المصنف سابقا.

Abstract

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introduction

النساء في أمريكا الشمالية لديهم خطر عمر٪ 12 ~ لتطوير سرطان الثدي ² ؛ فإن الغالبية العظمى من هؤلاء الأفراد سوف يكون الأورام الأولية إزالتها عن طريق الجراحة، واعتمادا على نوع فرعي السرطان، وبعد ذلك تلقي المستهدفة والغدد الصماء، تشيمو و / أو العلاج الإشعاعي في إعداد مساعد ³ . ومن الأمثلة على ذلك، النساء المشخصات بسرطانات إيجابية مستقبلات هرمون تلقي علاجات مضادة للإستروجين والنساء مع الأورام HER2 إيجابية تلقي العلاجات المستهدفة HER2 مع الإشعاع / العلاج الكيميائي، في حين لا توجد علاجات المستهدفة متوفرة حتى الآن للأورام السالبة الثلاثي ³ . على الرغم من التقدم في العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي والعلاجات الشخصية المعتمدة على الهرمونات التي تكمل الاستئصال الجراحي، يتكرر المرض في 30-70٪ من النساء المشخصات مع المرحلة الثانية أو الثالثة المرض ⁴ ، والعلاج غير فعالة إلى حد كبير في القضاء على المرض النقيلي في الأعضاء البعيدة، بما في ذلك الرئة، العظام، bالمطر و / أو الكبد ⁵ . وهذا أمر مهم بشكل خاص نظرا لأنه عندما يحدث المرض النقيلي في غياب نمو الورم الأولي، وهذا يعني أن الخلايا الخبيثة نشرها من المرجح أن تكون موجودة بالفعل في الأعضاء الثانوية في وقت الجراحة النهائية. وبالتالي هناك حاجة ملحة للعلاجات القادرة على استئصال أو بطء نمو الأورام النقيلي.

في حين أن نماذج دي نوفو الماوس من مسرطنة الثديية كانت مفيدة بشكل ملحوظ في الكشف عن آليات تنظيم تطور الورم ¹ ، النماذج الموجودة لديها أيضا العديد من القيود. واحدة من هذه هي أن النماذج المعدلة وراثيا دي نوفو عادة تطوير الأورام الأولية في الغدد الثديية متعددة، حيث عبء الورم الأساسي يحد من مدة الدراسات. في حين أن هروب الخلايا السرطانية الأولية والبذر المنتشر من المحتمل أن يحدث في وقت مبكر في تطور الورم في هذه النماذج، والتنمية الصريحة للأورام النقيلي يحدث في وقت متأخر، واعتماد سن نموذج الفأر وخلفية سلالة، وغالبا ما اختراق جزئيا ¹ . وهذا يزيد من الحد من فائدة نماذج دي نوفو لاكتشاف الجزيئات التي تنظم الانبثاث في الأعضاء الثانوية، وتقييم الفعالية قبل السريرية من العلاجات في إعداد مساعد.

للتحايل على هذه القيود، قمنا بتطوير نموذج جديد دي نوفو من ورم خبيث سرطان الثدي إلى الرئتين. الوراثة المعدلة وراثيا الإناث ( أي متف-بيمت على خلفية ففب / ن سلالة للدراسات الموصوفة هنا) التي تحمل أواخر مرحلة دي نوفو الأورام الثديية تتراوح أعمارهم بين ~ 100 أيام ⁶ ، وعند هذه النقطة يتم استئصال أورامها الأولية جراحيا وانفصل إنزيميا إلى تعليق خلية واحدة. يتم تعليق تعليق (1 × 10 ⁶ خلايا) بدورها أورثوتوبيكالي في 6-7 أسبوع المستلم الفئران الإناث المتجانسة، حيث تتطور الأورام الثديية الأولية واحدة على مدى فترة 38 إلى 60 يوما ( الشكل 1A). في حجم الورم المحدد (172 إلى 450 مم ³ )، يتم تخدير الفئران المتلقي والأورام الأولية يتم استئصالها جراحيا بحيث يتم تصغير نمو الورم في الموقع الجراحي، بما يتفق مع الجراحة في النساء ( الشكل التكميلي 1 ). على خلفية ففب / ن سلالة، الفئران تطوير نسيجيا البؤر النقيلي في الرئتين مع 45٪ اختراق من قبل ~ 115 يوما بعد الجراحة ( الشكل 1B ). مع هذا الكمون ممتدة من نمو الورم النقيلي، ويتم وضع نموذج فريد لتقديم العلاج المساعد، ولتوضيح وتقييم البيولوجيا الأساسية التي تؤثر على التقدم النقيلي بعد الاستئصال الجراحي للأورام الأولية.

Protocol

وتغطي الحيوانات المستخدمة في البروتوكول التالي من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي جامعة ولاية أوريغون للعلوم (إاكوك)، والتي تم تصميمها لتكون متوافقة مع لوائح قانون رعاية الحيوان وخدمة الصحة العامة (فس) السياسة.

صيانة الظروف المعقمة: يجب أن تستخدم أدوات معقمة وبين الفئران، وينبغي أن تمحى نظيفة بشاش معقم، وتشطف في برنامج تلفزيوني تليها التعقيم مع مطهر الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل. يجب ارتداء قبعة الجراحية، قناع الوجه، ثوب، والقفازات للعمليات الجراحية البقاء على قيد الحياة. يتم تضمين إعداد قبل الجراحة للحيوان لعمليات الجراحة في البروتوكول التالي. راجع الجدول 1 للحصول على قائمة من الكواشف والمعدات.

1. عزل وتحضير تعليق خلية واحدة من الأورام الثديية الأولية

1. تخدير الإناث المانحة 100 يوم المعدلة وراثيا متف-بيمت (ففب / ن) الفئران والحفاظ على تحت جالتخدير الشاذ عن طريق إعطاء 2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع التخدير. تأكد من أن الماوس تخدير بشكل صحيح مع غائبة منعكس القدم قرصة.
2. في وضع معقمة، استئصال الأورام الثديية الأولية من 100 سنة من العمر المعدلة وراثيا الإناث متف-بيمت (ففب / ن) الفئران عن طريق فصل الورم الثديي من المغطي الجلد والمحيطة الأنسجة الدهنية و / أو العقد الليمفاوية باستخدام مقص العقيمة. الموت ببطء الفئران تخدير عن طريق خلع عنق الرحم.
3. مع مقص العقيمة أو مشرط، اللحم المفروم الأورام الأولية يدويا إلى قطع صغيرة (~ 1.0 مم ³ ). مكان قطع الورم في 3.0 ملغ / مل كولاجيناز A و 4.0 U / مل دناز أنا حل في دمم. استخدام ~ 10 مل من المتوسطة الهضم أعلاه لكل 1.0 سم ورم القطر.
   1. أداء عملية الهضم في زجاجة معقمة 25 مل مع شريط ضجة معقمة في ~ 125 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
4. وقف الهضم عن طريق إضافة مصل الأبقار الجنين (فبس) إلى التخفيف النهائي من 10٪ ووضع الخليط بأكمله على wو الجليد حيث يتم الحفاظ عليه.
5. تصفية تعليق الورم هضمها من خلال مصفاة النايلون 0.7 ميكرون في أنبوب مخروطي 50 مل وتجاهل أي ورم المتبقية في مصفاة. الطرد المركزي طاف في 300 x ج في 4 درجات مئوية.
6. ريسوسبيند بيليه في 10 مل دمم لكل 1.0 سم الورم وإعادة تصفية من خلال مصفاة النايلون 0.7 ميكرون. عد تركيز الخلية، ثم الطرد المركزي في 300 x ج في 4 درجات مئوية.
7. ريسوسبيند بيليه في 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل مع 90٪ فبس في تركيز 2 × 10 ⁷ خلايا حية / مل. تخزين تعليق خلية واحدة من الورم الرئيسي كله في -80 درجة مئوية.

2. أورثوتوبيك حقن الورم الثديي

1. جزئيا ذوبان الجليد المجمدة تعليق الورم الأساسي عند 37 درجة مئوية حتى يمكن تحريرها بيليه المجمدة من أنبوب المبردة إلى 20 مل دمم وعد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج في 4 درجات مئوية و ريسوسبيند الخلايا في 1: 1 دمم: خفض عامل النمو سولوبيليزد الطابق السفلي غشاء إعداد البريدشتراكتد من ساركوما الماوس إنجلبريث-هولم-سرب (إهس) بتركيز 1 × 10 ⁷ خلية / مل (انظر جدول المواد ).
2. وضع المستلقي تخدير الإناث سينجينيك الماوس بطني الجانب حتى والحفاظ على تحت التخدير المستمر عن طريق إعطاء 2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع التخدير.
3. تعقيم الحق 4 الغدة الثديية موقع الحقن باستخدام الهباء 70٪ من الإيثانول وتطبيق بولي (فينيلبيروليدون) -Iodine مع مسحة القطن العقيمة.
4. حقن 100 ميكرولتر (1 × 10 ⁶ خلايا حية من المجمدة تعليق الورم الأساسي) شطبة الجانب حتى في حق غير واضح 4 الغدة الثديية من 6 إلى 10 من العمر الإناث ففب / ن الماوس بعمر باستخدام 29 G 0.3 مل حقن الأنسولين.

3. الاستئصال الجراحي للورم الثديي مثلي

1. 38-60 أيام التالية حقن الخلايا السرطانية، الموت ببطء الفئران لا تظهر حجم الورم مثلي تتراوح بين 172 إلى 450 مم ³ في حجم [طول × (عرض ² ) / 2] (حوالي 75٪ من الفئران المحقونة).
2. وضع الفئران تخدير عرض حجم الورم المناسب بطني الجانب حتى تحت التخدير المستمر عن طريق إعطاء 2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع التخدير وتأكيد الماوس تخدير صحيح مع غائبة القدم قرصة المنعكس. تطبيق طبيب بيطري مرهم للعيون للوقاية من جفاف بينما تحت التخدير.
3. رش 70٪ من الإيثانول لتعقيم المنطقة الجراحية المحيطة الورم الرئيسي، ثم تطبيق بولي (فينيلبيروليدون) -Iodine مع مسحة القطن العقيمة.
   ملاحظة: إزالة الشعر في الموقع الجراحي أسفرت عن إكسكورياتيونس الجلد و / أو العدوى ل ~ 5٪ الفئران وبالتالي تم استبعادها من هذه الخطوة (لا تظهر البيانات).
4. كما هو مبين في الشكل 1C ، وجعل شق الجلد الأولي باستخدام مقص حادة الإنسي الذيلية إلى الورم.
5. المقبل، وجعل ختان متفوقة من الجلد ( الشكل 1C ) الإنسي إلى الورم. إيلاء الاهتمام للحاجة إلى كيوي أي الأوعية الدموية فيتحرير الورم الموجود على الجلد قبل توسيع شق.
6. مواصلة شق الجلد أفقيا (الخلفي إلى الورم)، ثم جعل متفوقة استئصال الجلد (الوحشي إلى ورم)، والختان وسطي (متفوقة على الورم) ( الشكل 1C ).
7. بعد أن تم استئصال الجلد كفافي حول الورم ( الشكل 1C )، ورفع الجلد المغطي تعلق على الورم باستخدام ملقط بينما حادة تشريح الورم بعيدا عن عضلات جدار البطن والحفاظ على الغدد الثديية سليمة.
8. تحديد (عن طريق تشريح حادة) وكوى السفن الكبيرة من خلال تشغيل ^ال 4 و 5 ^تشرين الغدد الثديية.
9. المكوس ما يقرب من نصف ^ال 4 و 5 ^تشرين الغدد الثديية في موقع الكي لتحرير الورم، المغطي الجلد، وأجزاء من الغدد الثديية (الشكل 1C).
10. في حالة النزيف، وتحديد النزيف بنشاطالسفن وعلى الفور كيو لهم. إذا تم فقدان أكثر من 250 ميكرولتر من الدم، واستبعاد الماوس من الدراسة والقتل ببطء عليه.
11. إغلاق مواقع الختان مع مقاطع الجرح باستخدام جرح مقطع أبل ( الشكل 1C ).
    ملاحظة: إزالة مقاطع الجرح 10 يوما بعد الجراحة مع مزيل كليب الجرح.
12. إدارة محلول ملحي معقم دافئ تحت الجلد (4٪ من وزن الجسم الحيوان) والحفاظ على الحارة الحيوان مع مصباح الحرارة. تحقق الحيوانات كل 5-10 دقيقة خلال الانتعاش من التخدير.
    ملاحظة: إدارة إما بوبيفاكين أو يدوكائين زيادة وفيات ما بعد الجراحة (لا تظهر البيانات). الفئران التي أظهرت علامات الألم (الحنق، غير راغبة في التحرك، وعدم العريس) 1 ساعة بعد الجراحة الموت الرحيم.
    1. مرة واحدة وقد تعافى الماوس تماما، إعادته إلى الشركة من الفئران الأخرى.

4. عزل ومعالجة الدم والرئة لتدفق الخلوي والأنسجة

<رأ>

في نهاية الدراسة، وإعداد الفئران لمختلف التقييمات هيستوباثولوجيك إذا رغبت في ذلك. 90 دقيقة قبل القتل الرحيم، وإعطاء كل الماوس حقن داخل الصفاق من برومودوكسيوريدين (بردو، 50 ميكروغرام / ز وزن الماوس) بتركيز 6.25 ميكروغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X.
ملاحظة: يتم استخدام الأسهم المجمدة من برومودوكسيوريدين المذاب في غضون 1 شهر بعد التحضير.

10 دقيقة قبل القتل الرحيم، مع تخدير الماوس، وجمع الدم ريتروربيتال (> 500 ميكرولتر) باستخدام أنابيب الشعرية هيبارينيزد، وبعد ذلك نقل إلى أنابيب المغلفة مع ديبوتاسيوم إدتا عقد على الجليد.

لإزالة الرئتين والأنسجة الثديية المتبقية، وجعل شق خط الوسط مع مقص من أسفل البطن إلى الفم لفضح تجاويف الصدر والبريتوني ( الشكل 2A )، وقشر الجلد أفقيا لفضح أيضا الحق المتبقية 4 ^ث و 5 ^ال ثديية الغدد.

استئصال الأنسجة الغدة الثديية المتبقية وفحص طر لاستبعاد نمو الورم الرئيسي من خلال تقييم المسلسل المقطعية الفورمالين ثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (فب) التي كتبها الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ ( الشكل التكميلي 1 ).

لإزالة الرئتين، وفتح جدار البطن إلى الحجاب الحاجز مع مقص، ثم الموت ببطء الحيوان عن طريق قطع الشريان الأورطي البطني لاستنزاف الدم قبل نضح الرئتين ( الشكل 2B -2C ).

قطع الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري من نهج البطن التأكد من تجنب الرئة والقلب. ثم، فضح الصدر عن طريق قطع الجانب الجانبي من القفص الصدري ( الشكل 2D ).

باستخدام إبرة 23 قياس على حقنة 20 مل، يروي الرئتين مع ~ 5.0 مل دبس (~ 10 مل / دقيقة) من خلال البطين الأيمن للقلب حتى تتحول الرئتين بيضاء تماما ( الشكل 2E -2F ). قطع على الفور القلب من السفينة الرئيسيةلس حتى الدم لا إعادة يروي في الرئة.

لأنسجة الرئة لتكون ثابتة ومعالجتها للتقييمات هيستوباثولوجيك، وحقن ~ 1.0 مل 10٪ الفورمالين في 4 درجات مئوية في الجانب الهوائية شطبة يتعرض حتى نحو الرئتين باستخدام إبرة 23 قياس ( الشكل 2G - 2H ). وقف حقن مرة واحدة يتم توسيع الرئتين تماما ومليئة تثبيتي ( الشكل 2I ).

استئصال فصوص الرئة من القصبة الهوائية، وإخماد إصلاح أنسجة الرئة في الفورمالين محايد مخزنة لتضمين البارافين لاحقة أو الوسط تجميد أوكت، في الإجراءات القياسية هيستوباثولوجيك.

تقييم كميا عبء النقيلي في الرئتين عن طريق سيكتيونينغ المسلسل من أنسجة الرئة فب وتقييم أقسام مشراح (100 ميكرون، ثلاثة عشر أقسام)، من قبل H & E تلطيخ ( الشكل 1B ).

النتائج

أكثر من 75٪ من الفئران المتلقية تلقي 1 × 10 ⁶ خلايا من الأورام الثديية الأولية المستمدة من الفئران متف-بيمت، وتطوير أدينوكارسينوماس الثديية واحدة تتراوح في الحجم من 172 إلى 450 مم ^{3 في} غضون 38-60 يوما (لا تظهر البيانات). ثم يتم تسجيل الفئران المؤهل...

Discussion

التعديلات وتحري الخلل وإصلاحه:

عندما تشريح الورم حادة بعيدا عن جدار البطن، قد يبقى الورم ملتصقا جدار البطن. وقد لوحظ هذا في <5٪ من الفئران حقن مع ورم (لا تظهر البيانات). للفئران مع الأورام ملتصقة بجدار البطن، والفأر يجب ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800