Хирургические процедуры и методология для модели доклинической мужи<em&gt; Де Ново</em&gt; Метастазы рака молочной железы

Резюме

Недоклинические доклинические модели, оценивающие адъювантную терапию, нацеленную на метастазы рака молочной железы. Чтобы решить эту проблему, мы разработали мышиную модель метастаза левожелудочной молочной железы аденокарциномы de novo , где терапию, вводимую в адъювантной обстановке (послеоперационная резекция первичных опухолей), можно оценить для эффективности при воздействии ранее высеваемых легочных метастазов.

Аннотация

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Введение

Женщины в Северной Америке имеют ~ 12% пожизненный риск развития рака молочной железы ^2; Большинство из этих людей будут иметь первичные опухоли, удаленные хирургическим путем, и в зависимости от подтипа рака, затем получат целевую, эндокринную, химио- и / или лучевую терапию в адъювантной обстановке ³ . Примеры включают, женщин с диагнозом рака гормон рецептор-положительным , получавших анти-эстроген терапии и женщин с HER2-позитивными опухолями , получающих HER2-мишенью терапии с лучевой / химиотерапии, в то время как нет целевой терапии еще не доступны для тройных негативных опухолей ^3. Несмотря на успехи в радиации, химиотерапии, персонализированный и гормонов на основе методов лечения , которые дополняют хирургическую резекцию, болезнь рецидивирует в 30-70% женщин с диагнозом II стадии или III болезни ^4, как терапия в значительной степени неэффективны в искоренении метастазирования в отдаленные органы, в том числе Легкие, кости, bДождь и / или печень ⁵ . Это особенно важно, учитывая, что, когда метастатическая болезнь возникает при отсутствии первичного роста опухоли, это означает, что рассеянные злокачественные клетки, вероятно, уже присутствовали во вторичных органах во время окончательной операции. Таким образом, срочно необходимы терапии, способные искоренить или замедлить рост метастатических опухолей.

В то время как мышиные модели de novo для канцерогенеза молочной железы были чрезвычайно информативны в выявлении механизмов, регулирующих прогрессирование новообразований ¹ , существующие модели также имеют несколько ограничений. Одним из них является тот факт, что de novo трансгенные модели обычно развивают первичные опухоли в множественных молочных железах, где первичная опухолевая нагрузка ограничивает продолжительность исследований. В то время как первичный побег опухолевых клеток и метастатическое высевание, вероятно, происходят в начале неопластического прогрессирования в этих моделях, откровенное развитие метастатических опухолей происходит поздно, и в зависимости отN модель мыши и фон деформации часто являются частично проникающими ¹ . Это еще больше ограничивает полезность моделей de novo для обнаружения молекул, регулирующих метастазы во вторичных органах, и для оценки доклинической эффективности терапии в условиях адъюванта.

Чтобы обойти эти ограничения, мы разработали автохтонную модель метаноза рака молочной железы в легкие de novo . Родительские трансгенные самок ( т. Е. MMTV-PyMT на фоне штамма FVB / n для исследований, описанных здесь), несущие поздние стадии опухолей молочной железы de novo, составл ют до 100 дней ⁶ , после чего их первичные опухоли хирургически ресецируют и ферментативно диссоциируют в Одноцепочечные суспензии. Суспензии (1 × 10 ⁶ клеток), в свою очередь, орто-оптически экспрессируются у 6-7-недельных сингенных женских мышей-реципиентов, где одиночные первичные опухоли молочной железы развиваются в течение периода от 38 до 60 дней ( Рисунок 1A). При определенном размере опухоли (от 172 до 450 мм ³ ) мышей-реципиентов анестезируют, а первичные опухоли хирургически подвергают резекции, так что восстановление опухоли на хирургическом участке минимизируется, что согласуется с хирургией у женщин ( фиг. 1 ). На фоне штамма FVB / n мыши развивают гистологически обнаруживаемые метастатические очаги в легких с 45% -ной пенетрантностью через ~ 115 дней после операции ( рис. 1B ). Благодаря этой расширенной латентности роста метастатической опухоли модель уникально позиционируется для доставки адъювантной терапии, а также для выяснения и оценки лежащей в основе биологии, влияющей на метастатическую прогрессию после хирургического удаления первичных опухолей.

протокол

Животные, используемые в следующем протоколе, охватываются Институтом по охране и использованию животных в Университете штата Орегон (IACUC), который призван соответствовать требованиям Закона об охране здоровья животных и политике общественного здравоохранения (PHS).

Обслуживание стерильных условий: Стерилизованные инструменты следует использовать, а между мышами следует протирать стерильной марлей, промыть в PBS, а затем стерилизовать 70% -ным этанолом дезинфицирующим средством в течение как минимум 15 минут. Хирургический колпачок, маска для лица, мантия и перчатки должны носить для выживания. Предварительная подготовка животного для операций по выживанию включена в следующий протокол. См. Таблицу 1 для списка реагентов и оборудования.

1. Выделение и подготовка суспензий одиночных клеток от первичных опухолей молочной железы

1. Анестезируйте донорскую женскую 100-летнюю трансгенную мышь MMTV-PyMT (FVB / n) и поддерживайте ее под cOntinuous sedation путем введения 2% изофлурана через анестезию. Убедитесь, что мышь правильно анестезирована отсутствующим рефлексом стопы.
2. В стерильной обстановке рассеивают первичные опухоли молочной железы у 100-летних трансгенных мышей MMTV-PyMT (FVB / n), выделяя опухоль молочной железы из кожи и окружающей жировой ткани и / или лимфатических узлов, используя стерильные ножницы. Усыпьте анестезированных мышей шейным дислокацией.
3. С помощью стерильных ножниц или скальпеля вручную перенесите первичные опухоли на мелкие кусочки (~ 1,0 мм ³ ). Поместите опухолевые кусочки в 3,0 мг / мл коллагеназы А и 4,0 ед. / Мл ДНКазы I, растворенной в DMEM. Используйте ~ 10 мл вышеуказанной пищеварительной среды на опухоль диаметром 1,0 см.
   1. Выполните переваривание в стерильной бутылке емкостью 25 мл со стерильной мешалкой при температуре ~ 125 об / мин и 37 ° C в течение 40 минут.
4. Остановите переваривание, добавив фетальную сыворотку крупного рогатого скота (FBS) до конечного разведения 10% и поместите всю смесь на wEt ice, где он поддерживается.
5. Отфильтруйте переваренную суспензию опухоли через нейлоновый фильтр 0,7 мкм в коническую трубку объемом 50 мл и отбросьте любую опухоль, оставшуюся в сетчатке. Центрифугируют супернатант при 300 × g при 4 ° C.
6. Ресуспендируют гранулу в 10 мл DMEM на 1,0 см опухоли и повторно фильтруют через 0,7 мкм нейлоновый фильтр. Считайте концентрацию клеток, затем центрифугируйте при 300 xg при 4 ° C.
7. Ресуспендированный осадок в 10% диметилсульфоксиде с 90% FBS в концентрации 2 × 10 ⁷ живых клеток / мл. Хранить одноклеточные суспензии цельной первичной опухоли при -80 ° C.

2. Ортотопическая инъекция опухоли молочной железы

1. Частично оттаивают замороженные первичные опухолевые суспензии при 37 ° С, пока замороженный осадок не может быть высвобожден из криогенной трубки в 20 мл DMEM и подсчет клеток. Центрифуга при 300 xg при 4 ° C и ресуспендирующие клетки в 1: 1 DMEM: восстановленный фактор-солюбилизированный препарат мембраны основания eXtracted от саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) в концентрации 1 × 10 ⁷ клеток / мл (см. Таблицу материалов ).
2. Поместите поджелудочную женскую абсентологическую вентральную сторону пациента и поддерживайте при непрерывном седативном воздействии путем введения 2% изофлурана через анестезию.
3. Стерилизуйте правую четвертую область инъекции молочной железы с использованием аэрозольного 70% этанола и применяя поли (винилпирролидон) -один с стерильным ватным тампоном.
4. Внесите 100 мкл (1 × 10 ⁶ живых клеток из замороженных первичных опухолевых суспензий), скошенную вверх в нечистую правую четвертую молочную железу 6-10-недельной мышиной мыши FVB / n, используя шприц для инъекций на 29 G 0,3 мл.

3. Хирургическая резекция ортотопической опухоли молочной железы

1. Через 38-60 дней после инъекции опухолевых клеток мышей эвтаназии, не имеющих объем ортотопических опухолей, в пределах от 172 до 450 мм ³ в объеме [длина х (ширина ² ) / 2] (около 75% введенных мышей).
2. Поместите обезболивающих мышей, имеющих надлежащую размерность опухоли вентральной стороной под непрерывным седативным эффектом, путем введения 2% изофлурана с помощью маски для анестезии и подтвердите, что мышь должным образом анестезирована отсутствующим рефлексом стопы. Нанесите ветеринарную мазь на глаза для предотвращения сухости во время седации.
3. Распылите 70% этанола для стерилизации хирургической области, окружающей первичную опухоль, затем нанесите Poly (винилпирролидон) -один с стерильным ватным тампоном.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Удаление волос на хирургическом участке приводило к эксорсированию и / или инфекциям кожи у мышей ~ 5% и поэтому исключалось из этого этапа (данные не показаны).
4. Как показано на рисунке 1С , сделайте начальный разрез кожи, используя тупые ножницы медиально-каудальные для опухоли.
5. Затем сделайте превосходное удаление кожи ( рис. 1C ) медиальной опухоли. Обратите внимание на необходимость прижигания любой сосудистой сетиУдаляя опухоль, расположенную на коже, перед расширением разреза.
6. Продолжите разрез кожи сбоку (позади опухоли), затем сделайте превосходное удаление кожи (поперечное к опухоли) и медиальное удаление (выше опухоли) ( рис. 1C ).
7. После того, как кожа была вырезана по окружности вокруг опухоли ( рис. 1C ), поднимите поверх кожи, прикрепленную к опухоли, используя щипцы, в то время как тупые рассекают опухоль от мускулатуры брюшной стенки и сохраняют целостность молочных желез.
8. Определите (путем тупой диссекции) и прижигайте крупные сосуды, проходящие через 4- ^ю и 5- ^ю молочные железы.
9. Акцизируйте приблизительно половину 4- ^й и 5- ^й молочных желез на участке прижигания, чтобы освободить опухоль, покрывающую кожу и сегменты молочных желез ( рис. 1С ).
10. В случае кровотечения, выявить активное кровотечениеСосудов и немедленно прижигать их. Если потеряно более 250 мкл крови, исключить мышь из исследования и усыпить ее.
11. Закройте участки эксцизии с помощью раневых зажимов с помощью раневого клипса ( рисунок 1С ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Удалите зажимы для раны через 10 дней после операции с помощью средства для снятия зажимов.
12. Администрировать теплый стерильный физиологический раствор подкожно (4% от веса тела животного) и держать животное в тепле с помощью тепловой лампы. Проверяйте животных каждые 5-10 минут во время выздоровления от анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Администрация либо бупивакаина, либо лидокаина увеличивала послеоперационную смертность (данные не показаны). Мыши, которые проявляли признаки боли (головокружение, нежелание двигаться, отказ жениха) через 1 ч после операции были подвергнуты эвтаназии.
    1. Как только мышь полностью восстановится, верните ее в компанию других мышей.

4. Изоляция и обработка крови и легких для проточной цитометрии и гистологии

<ол>

В конечных точках исследования при необходимости подготовьте мышей для различных гистопатологических оценок. 90 мин до эвтаназии, дайте каждой мыши внутрибрюшинную инъекцию бромдезоксиуридина (BrdU, 50 мкг / г массы мыши) при концентрации 6,25 мкг / мкл в 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ. Замороженные запасы растворенного бромдезоксиуридина используются в течение 1 месяца после приготовления.

За 10 мин до эвтаназии, с анестезией мышей, собираем ретроорбитальную кровь (> 500 мкл) с использованием гепаринизированных капиллярных трубок и затем переносим на трубки, покрытые дикалием ЭДТА, содержащиеся на льду.

Чтобы удалить легкие и оставшуюся молочную ткань, сделайте срединный разрез ножницами от нижней части живота до рта, чтобы обнажить грудную и брюшную полости ( рис. 2A ), и очистить кожу латерально, чтобы также выявить оставшиеся правые 4- ^й и 5- ^й молочные железы железы.

Акцизируйте оставшуюся ткань молочной железы и осмотрите iT, чтобы исключить первичный рост опухоли путем оценки сериализованной формалин-фиксированной ткани с парафином (FFPE) путем окрашивания гематоксилином и эозином (H & E) ( дополнительный рисунок 1 ).

Чтобы удалить легкие, откройте брюшную стенку с диафрагмой ножницами, затем эвтаназируйте животное, разрезав брюшную аорту, чтобы слить кровь до перфузии легких ( рисунок 2B -2C ).

Вырежьте диафрагму вдоль грудной клетки от абдоминального подхода, чтобы избежать легкого и сердца. Затем обнажите грудную клетку, прорезав боковые стороны грудной клетки ( рис. 2D ).

Используя иглу 23 калибра на 20 мл шприце, перфузируйте легкие с ~ 5,0 мл DPBS (~ 10 мл / мин) через правый желудочек сердца, пока легкие полностью не станут белыми ( рисунок 2E -2F ). Немедленно отрезать сердце от главного сосудаТак что кровь не реперфузируется в легкие.

Для того чтобы легочную ткань фиксировали и обрабатывали для гистопатологических оценок, вводили ~ 1,0 мл 10% формалина при 4 ° С в обнаженную сторону трахеи трахеи вверх в легкие с помощью иглы 23-го калибра ( рисунок 2G- 2H ). Прекратите инъекцию, когда легкие полностью расширены и заполнены фиксатором ( рисунок 2I ).

Извлеките легочные лепестки из трахеи и удалите легочную ткань в нейтральный буферный формалин для последующего введения парафина или OCT-замораживающей среды в соответствии с стандартными гистопатологическими процедурами.

Количественно оценивать метастатическую нагрузку в легких путем последовательного секвенирования легочной ткани FFPE и оценивать участки микротома (100 мкм, тринадцать секций), путем окрашивания H & E ( рисунок 1B ).

Результаты

Более 75% мышей-реципиентов, получавших 1 × 10 ⁶ клеток от первичных опухолей молочной железы, полученных от мышей MMTV-PyMT, развивали одиночные аденокарциномы молочной железы размером от 172 до 450 мм ^{3 в} течение 38-60 дней (данные не показаны). Мыши, имеющие право на ра?...

Обсуждение

Модификации и устранение неполадок:

Когда тупой рассекающий опухоль удаляется от брюшной стенки, опухоль может оставаться прикрепленной к брюшной стенке. Это наблюдалось у <5% мышей, которым вводили опухоль (данные не показаны). Для мышей с опухолями, прилипши?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800