Procédures chirurgicales et méthodologie pour un modèle murin préclinique de<em&gt; De Novo</em&gt; Métastase du cancer mammaire

Résumé

Les modèles précliniques évaluant la thérapie adjuvante ciblant les métastases du cancer du sein sont insuffisants. Pour remédier à cela, nous avons développé un modèle murin de métastases de l'adénocarcinome mammaire pulmonaire de novo , dans lequel les thérapies administrées dans le milieu adjuvant (résection post-chirurgicale des tumeurs primaires) peuvent être évaluées en fonction de l'impact sur les métastases pulmonaires préalablement ensemencées.

Résumé

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introduction

Les femmes en Amérique du Nord ont un risque de croissance de cancer du sein de ~ 12% à vie ² ; La plupart de ces personnes auront des tumeurs primaires éliminées par voie chirurgicale, et selon le sous-type de cancer, recevront alors une thérapie ciblée, endocrinienne, chimiothérapie et / ou radiologique dans le cadre adjuvant ³ . Les exemples incluent les femmes diagnostiquées avec des cancers positifs aux récepteurs hormonaux recevant des thérapies anti-oestrogènes et des femmes atteintes de tumeurs positives à l'HER2 recevant des thérapies ciblées par HER2 avec radiothérapie / chimiothérapie, alors qu'aucune thérapie ciblée n'est encore disponible pour les tumeurs négatives ³ . Malgré les progrès dans les traitements radiologiques, de chimiothérapie, personnalisés et hormonaux qui complètent la résection chirurgicale, la maladie se retrouve chez 30 à 70% des femmes diagnostiquées avec une maladie de stade II ou III ⁴ , car les thérapies sont largement inefficaces dans l'élimination de la maladie métastatique dans les organes distants, y compris Poumon, os, bPluie et / ou foie ⁵ . Ceci est particulièrement important étant donné que lorsque la maladie métastatique se produit en l'absence de repousse tumorale primaire, cela implique que les cellules malignes disséminées étaient probablement déjà présentes dans les organes secondaires au moment de la chirurgie définitive. Ainsi, les traitements capables d'éradiquer ou de ralentir la croissance des tumeurs métastatiques sont nécessaires de toute urgence.

Alors que les modèles de souris de nouveau de la carcinogenèse mammaire ont été remarquablement informatifs dans les mécanismes révélateurs régissant la progression néoplasique ¹ , les modèles existants ont également plusieurs limites. L'un d'entre eux est le fait que les modèles transgéniques de novo développent généralement des tumeurs primaires dans de multiples glandes mammaires, dans lesquelles le fardeau tumoral primaire limite la durée des études. Bien que l'évasion de cellules tumorales primaires et l'ensemencement métastatique se produisent probablement au début de la progression néoplasique dans ces modèles, le développement franche de tumeurs métastatiques se produit tardivement et en fonction deN le modèle de la souris et le fond de la déformation, est souvent partiellement pénétrant ¹ . Cela limite encore l'utilité des modèles de novo pour la découverte de molécules régulant les métastases dans les organes secondaires et pour évaluer l'efficacité préclinique de la thérapeutique dans le milieu adjuvant.

Pour contourner ces limites, nous avons développé un modèle autochtone nouveau de métastase de carcinome mammaire dans les poumons. Femelles transgéniques parentales (c. -à- MMTV-PyMT sur le FVB / N fond de contrainte pour les études décrites ici) portant un stade avancé de novo des tumeurs mammaires sont vieillis à environ 100 jours ^6, à quel point les tumeurs primaires sont chirurgicalement réséquées et enzymatiquement dissociées en Suspensions cellulaires simples. Les suspensions (1 x 10 ⁶ cellules) sont à leur tour expliquées orthotopiquement chez des souris femelles syngéniques réceptrices de 6-7 semaines, où des tumeurs mammaires primaires primaires se développent sur une période de 38 à 60 jours ( Figure 1A). À une taille de tumeur définie (172 à 450 mm ³ ), les souris destinataires sont anesthésiées et les tumeurs primaires sont résistées chirurgicalement de sorte que la repousse de la tumeur au site chirurgical est minimisée, conformément à la chirurgie chez les femmes ( Figure complémentaire 1 ). Sur le fond de la souche FVB / n, les souris développent des foyers métastatiques histologiquement détectables dans les poumons avec une pénétrance de 45% par ~ 115 jours après la chirurgie ( figure 1B ). Avec cette latence prolongée de la croissance tumorale métastatique, le modèle est idéalement positionné pour la distribution de la thérapie adjuvante et pour élucider et évaluer la biologie sous-jacente influençant la progression métastatique suite à l'élimination chirurgicale des tumeurs primaires.

Protocole

Les animaux utilisés dans le protocole suivant sont couverts par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Oregon Health & Science (IACUC), qui est conçu pour être conforme aux règlements de la Loi sur le bien-être animal et à la Politique sur le service de santé publique (PHS).

Entretien des conditions stériles: les instruments stérilisés doivent être utilisés et entre les souris doivent être nettoyés avec de la gaze stérile, rincés dans du PBS, puis stériliser avec un désinfectant à 70% d'éthanol pendant au moins 15 minutes. Un casque chirurgical, une manchette, une robe et des gants devraient être portés pour des chirurgies de survie. La préparation préopératoire de l'animal pour les chirurgies de survie est incluse dans le protocole suivant. Reportez-vous au tableau 1 pour une liste des réactifs et du matériel.

1. Isolation et préparation de suspensions cellulaires simples à partir de tumeurs mammaires primaires

1. Anesthésier les souris donneuses de 100 jours de MMTV transgéniques-PyMT (FVB / n) et maintenir sous cSédation ontinuous en administrant 2% d'isoflurane via un masque d'anesthésie. Confirmez que la souris est correctement anesthésiée avec un réflexe de pincement de pied absent.
2. Dans un contexte stérile, résister aux tumeurs mammaires primaires chez les souris MMTV-PyMT (FVB / n) transgéniques femelles de 100 jours en séparant la tumeur mammaire de la peau sus-jacente et des tissus adipeux environnants et / ou des ganglions lymphatiques à l'aide de ciseaux stériles. Euthanaser les souris anesthésiées par dislocation cervicale.
3. Avec des ciseaux stériles ou un scalpel, pique les tumeurs primaires manuellement en petits morceaux (~ 1,0 mm ³ ). Placez les morceaux de tumeur dans 3,0 mg / mL de collagénase A et 4,0 U / ml de DNase I dissous dans du DMEM. Utiliser ~ 10 ml du milieu de digestion ci-dessus pour une tumeur de 1,0 cm de diamètre.
   1. Effectuer la digestion dans un flacon stérile de 25 ml avec une barre d'agitation stérile à ~ 125 tr / min et 37 ° C pendant 40 min.
4. Arrêtez la digestion en ajoutant du sérum bovin fœtal (FBS) à une dilution finale de 10% et placez le mélange entier sur wEt la glace où elle est maintenue.
5. Filtrer la suspension de tumeur digérée à travers un filtre de nylon de 0,7 μm dans un tube conique de 50 ml et éliminer toute tumeur restant dans la crépine. Centrifuger le surnageant à 300 xg à 4 ° C.
6. Remettre en suspension la pastille dans 10 mL de DMEM par tumeur de 1,0 cm et ré-filtrer à travers une crépine de nylon de 0,7 μm. Déterminer la concentration des cellules, puis centrifuger à 300 xg à 4 ° C.
7. Remettre en suspension la pastille dans du diméthylsulfoxyde à 10% avec 90% de FBS à une concentration de 2 x 10 ⁷ cellules vivantes / mL. Stocker des suspensions monocellulaires de tumeur primaire entière à -80 ° C.

2. Injection orthotopique de la tumeur mammaire

1. Décongeler partiellement les suspensions de tumeurs primaires congelées à 37 ° C jusqu'à ce que la pastille congelée puisse être libérée du tube cryogénique dans 20 mL de DMEM et compter les cellules. Centrifuger à 300 xg à 4 ° C et remettre en suspension les cellules dans un DMEM 1: 1: facteur de croissance - préparation réduite de la membrane solaire solubilisée eTiré du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) à une concentration de 1 x 10 ⁷ cellules / mL (voir la Table des matières ).
2. Placez le côté ventral synagénétique anesthésique de la ventre gauche et maintenez-le sous sédation continue en administrant 2% d'isoflurane via un masque d'anesthésie.
3. Stériliser le bon site de la 4ème injection mammaire mammaire en utilisant de l'éthanol à 70% en aérosol et appliquer Poly (vinylpyrrolidone) -Idéine avec un coton-tige stérile.
4. Injecter 100 μL (1 x 10 ⁶ cellules vivantes à partir de suspensions de tumeurs primaires congelées) côté biseau vers le haut dans la 4ème glande mammaire non éclairée de la FVB / n femelle de 6 à 10 semaines utilisant une seringue à insuline de 29 G 0,3 ml.

3. Résection chirurgicale de la tumeur mammaire orthotopique

1. 38 à 60 jours après l'injection de cellules tumorales, euthanasier des souris ne présentant pas de volumes de tumeurs orthotopiques allant de 172 à 450 mm ³ en volume [longueur x (largeur ² ) / 2] (environ 75% de souris injectées).
2. Placez des souris anesthésiées ayant une taille de tumeur appropriée dans le ventral vers le haut sous sédation continue en administrant 2% d'isoflurane via un masque d'anesthésie et confirmez que la souris est correctement anesthésiée avec un réflexe de pincement de pied absent. Appliquer une pommade vétérinaire aux yeux pour prévenir la sécheresse pendant la sédation.
3. Pulvériser 70% d'éthanol pour stériliser la zone chirurgicale entourant la tumeur primaire, puis appliquer Poly (vinylpyrrolidone) -Iodine avec un coton-tige stérile.
   NOTE: L'épilation au site chirurgical a entraîné des excoriations de la peau et / ou des infections pour ~ 5% de souris et a donc été exclue de cette étape (données non présentées).
4. Comme le montre la figure 1C , faites une incision cutanée initiale à l'aide de ciseaux brusques à l'intérieur de la tumeur.
5. Ensuite, faites une excision supérieure de la peau ( Figure 1C ) à l'intérieur de la tumeur. Faites attention à la nécessité de cautériser toute vasculature feÉmettant la tumeur située sur la peau avant d'étendre l'incision.
6. Continuer l'incision cutanée latéralement (postérieure à la tumeur), puis effectuer une excision cutanée supérieure (latérale à la tumeur) et une excision médiale (supérieure à la tumeur) ( figure 1C ).
7. Une fois que la peau a été excisée circonférentiellement autour de la tumeur ( Figure 1C ), soulevez la peau qui recouvre la tumeur en attaquant la tumeur en utilisant une pince tout en disséquant la tumeur loin de la musculature de la paroi abdominale et en gardant les glandes mammaires intactes.
8. Identifier (par dissection) et cautériser les grands navires qui traversent les 4 ^ème et 5 ^ème glandes mammaires.
9. Accise environ la moitié de la 4 ^ème et 5 ^ème glandes mammaires sur le site de cautérisation pour libérer la tumeur, de la peau sus - jacente, et les segments des glandes mammaires (figure 1c).
10. En cas de saignement, identifiez le saignement actifEt les cautériser immédiatement. Si plus de 250 μL de sang est perdu, exclure la souris de l'étude et l'euthanasier.
11. Fermez les sites d'excision avec des clips enroulés à l'aide d'un applicateur de clip enroulé ( Figure 1C ).
    REMARQUE: Retirez les bouchons de la plaie 10 jours après la chirurgie avec un décapant de bande blessure.
12. Administrer une solution saline stérile chaude par voie sous-cutanée (4% du poids corporel de l'animal) et garder l'animal chaud avec une lampe chauffante. Vérifiez les animaux tous les 5-10 min pendant la récupération de l'anesthésie.
    NOTE: L'administration de bupivacaïne ou de lidocaïne a augmenté la mortalité post-opératoire (données non présentées). Les souris qui présentaient des signes de douleur (hunching, ne voulant pas se déplacer, absence de toilettage) 1 h après la chirurgie ont été euthanasiées.
    1. Une fois la souris complètement récupérée, renvoyez-la à la société d'autres souris.

4. Isolation et traitement du sang et du poumon pour la cytométrie et l'histologie du flux

1. Aux points d'évaluation de l'étude, préparer des souris pour diverses évaluations histopathologiques si désiré. 90 min avant l'euthanasie, donner à chaque souris une injection intrapéritonéale de bromodeoxyuridine (BrdU, 50 μg / g de poids de souris) à une concentration de 6,25 μg / μL dans 1x PBS.
   NOTE: Les stocks congelés de bromodésoxyuridine dissoute sont utilisés dans un mois après la préparation.
2. 10 min avant l'euthanasie, avec la souris anesthésiée, collecter du sang rétroorbital (> 500 μL) en utilisant des tubes capillaires héparinés et ensuite transférer sur des tubes revêtus d'EDTA dipotassique sur glace.
3. Pour éliminer les poumons et les tissus mammaires restants, effectuer une incision de la ligne médiane avec des ciseaux du bas de l'abdomen jusqu'à la bouche pour exposer les cavités thoraciques et péritonéales ( Figure 2A ) et éplucher la peau latéralement pour exposer également les 4 ^th et 5 ^th mammaire Les glandes.
4. Accepter le tissu mammaire mammaire restant et examiner iT pour exclure la repousse de la tumeur primaire en évaluant le tissu intégré à la paraffine fixée au formol (FFPE) en série par la coloration par l'hématoxyline et l'éosine (H & E) ( Figure complémentaire 1 ).
5. Pour enlever les poumons, ouvrir la paroi abdominale sur le diaphragme avec des ciseaux, puis éuthanasier l'animal en coupant l'aorte abdominale pour évacuer le sang avant la perfusion de poumons ( Figure 2B- 2C ).
6. Coupez le diaphragme le long de la cage thoracique d'une approche abdominale en vous assurant d'éviter les poumons et le cœur. Ensuite, exposez le thorax en découpant les côtés latéraux de la cage thoracique ( figure 2D ).
7. À l'aide d'une aiguille de calibre 23 sur une seringue de 20 mL, perfusez des poumons avec ~ 5,0 mL de DPBS (~ 10 mL / min) par le ventricule droit du cœur jusqu'à ce que les poumons deviennent entièrement blancs ( Figure 2E -2F ). Couper immédiatement le cœur de la vence principalePar conséquent, le sang ne re-perfuse pas dans le poumon.
8. Pour que les tissus pulmonaires soient réparés et traités pour des évaluations histopathologiques, injecter 1,0 ml de formol à 10% à 4 ° C dans le coin de la trachée exposée vers le haut vers les poumons en utilisant une aiguille de calibre 23 ( Figure 2G - 2H ). Cesser l'injection une fois que les poumons sont complètement expansés et remplis de fixateur ( figure 2I ).
9. Les lobes des poumons d'accise de la trachée et l'émersion fixent le tissu pulmonaire dans un formol tampon neutre pour l'insertion ultérieure de paraffine ou le milieu congélateur OCT, selon les procédures histopathologiques standard.
10. Évaluer quantitativement le fardeau métastatique dans les poumons par séparation en série du tissu pulmonaire FFPE et évaluer les sections de microtome (100 μm, treize sections), par coloration H & E ( figure 1B ).

Résultats

Plus de 75% des souris recevant 1 x 10 ⁶ cellules provenant de tumeurs mammaires primaires dérivées de souris MMTV-PyMT, développent des adénocarcinomes mammaires simples allant de 172 à 450 mm ³ dans les 38 à 60 jours (données non présentées). Les souris admissibles à la randomisation sont ensuite inscrites dans les groupes d'étude suite à la résection chirurgicale des tumeurs primaires, comme indiqué ( Figure 1C ). L...

Discussion

Modifications et dépannage:

Lorsqu'une tumeur disséquante qui se dissout loin de la paroi abdominale, la tumeur peut rester adhérente à la paroi abdominale. Ceci a été observé chez <5% de souris injectées avec une tumeur (données non présentées). Pour les souris atteintes de tumeurs adhérentes à la paroi abdominale, la souris doit être euthanasiée car la résection est difficile sans repousse primaire de la tumeur.

L...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800