临床前小鼠模型的外科手术和方法<em&gt; De Novo</em&gt;乳腺癌转移

摘要

评估靶向乳腺癌转移的辅助治疗的临床前模型缺乏。为了解决这个问题，我们开发了从头肺乳腺癌转移，其特征在于，在辅助设定（后手术切除原发肿瘤的）给药的治疗可以为疗效影响先前接种的肺转移进行评估的鼠模型。

摘要

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

引言

北美地区的女性患乳腺癌的终生风险约为12％ ² ;大多数这些个体将通过手术去除原发性肿瘤，并且依赖于癌症亚型，然后将在佐剂设置中接受靶向的内分泌，化疗和/或放射治疗³ 。诊断为接受抗雌激素治疗的激素受体阳性癌症妇女和接受HER2靶向治疗的HER2阳性肿瘤的妇女与放射治疗/化疗相关的实例包括:三重阴性肿瘤尚无靶向治疗³ 。尽管在放疗，化疗，个性化和基于激素疗法的进步是补充手术切除，复发的疾病诊断为II期或III期疾病^有4名妇女的30％-70％，由于治疗是在远处器官转移根除疾病很大程度上是无效的，包括肺，骨，b雨和/或肝脏⁵ 。这是特别重要的，因为当没有原发性肿瘤再生长时发生转移性疾病时，这意味着在确定性手术时传播的恶性细胞可能已经存在于二级器官中。因此迫切需要能够消除或减缓转移性肿瘤生长的治疗方法。

虽然乳腺癌发生的从头鼠模型在揭示调节肿瘤进展^1的机制方面已经非常显着，但现有模型也有一些限制。其中之一是事实， 从头转基因模型通常在多个乳腺中发展原发性肿瘤，其中原发性肿瘤负担限制了研究的持续时间。虽然原发性肿瘤细胞逃逸和转移性种子可能在这些模型的肿瘤进展早期发生，但是转移性肿瘤的坦率发展发生在晚期，而且依赖于n小鼠模型和应变背景，经常部分渗透¹ 。这进一步限制了从头模型发现调节继发器官转移的分子的效用，以及用于评估治疗剂在辅助治疗中的临床前功效。

为了规避这些局限性，我们开发了一种乳腺癌转移到肺的从头自体模型。携带晚期从头乳腺肿瘤的父母转基因雌性（ 即 ，本文所述用于研究的FVB / n株系背景上的MMTV-PyMT）老化至〜100天⁶ ，此时，其原发性肿瘤经手术切除并酶解解为单细胞悬液悬浮液（1×10 ^6个细胞）又原位移植到6-7周龄的受体同基因雌性小鼠中，其中单一原发性乳腺肿瘤发生在38至60天的时间段图1A）。在确定的肿瘤大小（172至450mm ³ ）处，将受体小鼠麻醉并手术切除原发性肿瘤，使得在手术部位的肿瘤再生长被最小化，与女性的手术一致（ 补充图1 ）。在FVB / n株系背景下，小鼠在手术后〜115天内以45％的外显率在肺中发展组织学检测的转移灶（ 图1B ）。随着转移性肿瘤生长的这种延长的延迟，该模型在辅助治疗递送中是独特的，并且用于阐明和评估影响原发性肿瘤手术切除后的转移进展的潜在生物学。

研究方案

以下协议中使用的动物由俄勒冈州健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）涵盖，该委员会旨在符合"动物福利法"条例和公共卫生服务（PHS）政策。

维持无菌条件:应使用灭菌仪器，小鼠之间应用无菌纱布擦拭，用PBS冲洗，然后用消毒剂70％乙醇灭菌至少15分钟。外科手术帽，面罩，长袍和手套应佩戴进行生存手术。用于生存手术的动物的手术前准备包括在以下方案中。有关试剂和设备的清单，请参阅表1。

1.从初级乳腺肿瘤中分离和制备单细胞悬液

1. 麻醉供体雌性100天龄转基因MMTV-PyMT（FVB / n）小鼠并维持在c通过麻醉面罩给予2％异氟烷的连续镇静。确认鼠标已被适当地麻醉，没有足部反射。
2. 在无菌环境中，通过使用无菌剪刀从上覆皮肤和周围脂肪组织和/或淋巴结中分离乳腺肿瘤，从100天龄的转基因雌性MMTV-PyMT（FVB / n）小鼠切除原发性乳腺肿瘤。通过颈椎脱位安乐死麻醉的小鼠。
3. 用无菌剪刀或手术刀将手术切成小块（〜1.0 mm ³ ）。将肿瘤片放在3.0mg / mL胶原酶A和4.0U / mL DNase I中溶解于DMEM中。每1.0厘米直径肿瘤使用〜10毫升上述消化培养基。
   1. 用无菌搅拌棒在无菌的25mL瓶中以〜125rpm和37℃进行消化40分钟。
4. 通过加入胎牛血清（FBS）至10％的最终稀释度来停止消化，并将整个混合物置于w上并保持冰。
5. 将消化的肿瘤悬浮液通过0.7μm尼龙过滤器过滤到50mL锥形管中，并丢弃残留在过滤器中的任何肿瘤。在4℃下以300xg离心上清液。
6. 将沉淀重悬于10ml DMEM / 1.0cm肿瘤中，并通过0.7μm尼龙过滤器再过滤。计数细胞浓度，然后在4℃下以300xg离心。
7. 将沉淀物重悬于10％二甲基亚砜与90％FBS浓度为2×10 ⁷活细胞/ mL。将整个原发肿瘤的单细胞悬液储存在-80°C。

2.原位乳头肿瘤注射

1. 部分解冻冷冻的原代肿瘤悬浮液在37°C，直到冷冻丸粒可以从低温管释放到20 mL DMEM中并计数细胞。在4℃下以300xg离心，并将细胞重悬于1:1 DMEM:生长因子减少的溶解基底膜制剂e以1×10 ^7个细胞/ mL的浓度从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中减量（参见材料表 ）。
2. 将麻醉的受体雌性同基因小鼠腹侧向上放置，并通过麻醉面罩施用2％异氟烷，保持连续镇静。
3. 使用雾化的70％乙醇灭菌右侧第4个乳腺注射部位，并用无菌棉签涂覆聚（乙烯基吡咯烷酮）碘。
4. 使用29 G 0.3 mL胰岛素注射器将100μL（来自冷冻原发性肿瘤悬浮液的1×10 ^6个活细胞）倾斜侧向上注入6至10周龄雌性FVB / n小鼠的未清除右侧第4个乳腺。

3.手术切除原位乳腺肿瘤

1. 肿瘤细胞注射后38-60天，安乐死不显示体积范围在172至450mm ³之间的原位肿瘤体积的长度x（宽度² ）/ 2]（约75％的注射小鼠）。
2. 通过麻醉面罩给予2％异氟烷，将连续镇静下的适当肿瘤大小腹侧放置麻醉小鼠，并确认小鼠用不足的脚捏反射适当地麻醉。在镇静时应用兽药软膏防止干燥。
3. 喷雾70％乙醇，对原发肿瘤周围的手术区进行消毒，然后用无菌棉签涂敷聚（乙烯基吡咯烷酮）碘。
   注意:手术部位的脱毛导致〜5％小鼠的皮肤剥离和/或感染，因此被排除在该步骤之外（数据未显示）。
4. 如图1C所示，使用钝刀中间尾部对肿瘤进行初始皮肤切口。
5. 接下来，使肿瘤内侧的皮肤（ 图1C ）更好地切除。注意灼烧任何脉管系统的需要在延伸切口之前，将位于皮肤上的肿瘤编织。
6. 继续皮肤切口（肿瘤后），然后进行优异的皮肤切除（肿瘤外侧）和内侧切除（优于肿瘤）（ 图1C ）。
7. 皮肤周围切除肿瘤周围（ 图1C ）后，使用镊子将附着于肿瘤的覆盖皮肤抬起，同时将肿瘤从腹壁肌肉组织中分离出来，并保持乳腺不受影响。
8. 识别（通过钝器解剖）和烧灼通过^第 4和^第 5乳腺运行大型船只。
9. 在烧灼部位消耗大约一半的第4和^第 5 ^个乳腺，以释放肿瘤，覆盖的皮肤和乳腺的部分（ 图1C ）。
10. 出血时，积极发现出血立即烧灼他们。如果超过250μL的血液丢失，请将小鼠从学习中排除并安乐死。
11. 使用伤口夹具将伤口夹紧闭切割部位（ 图1C ）。
    注意:手术后10天用伤口夹去除剂取下伤口夹。
12. 皮下施用温暖的无菌生理盐水（占动物体重的4％），并用热灯保持动物温暖。在麻醉恢复期间每5-10分钟检查动物。
    注意:施用布比卡因或利多卡因会增加术后死亡率（数据未显示）。手术后1小时，出现疼痛迹象（臀部，不愿意移动，无法修复）的小鼠安乐死。
    1. 一旦鼠标完全恢复，返回到其他老鼠的公司。

血液和肺的分离和处理用于流式细胞术和组织学

1. 在研究终点，如果需要，准备小鼠进行各种组织病理学评估。在安乐死前90分钟，给予每只小鼠腹膜内注射浓度为6.25μg/μL的1×PBS中的溴脱氧尿苷（BrdU，50μg/ g小鼠重量）。
   注意:冷冻储存的溶解的溴脱氧尿苷在制备后1个月内使用。
2. 在安乐死前10分钟，麻醉小鼠，使用肝素化毛细管收集后蹄血（> 500μL），随后转移到涂有冰上的EDTA二钾管。
3. 为了去除肺部和残留的乳腺组织，用剪刀从下腹部到口部进行中线切口以暴露胸腔和腹腔（ 图2A ），并横向剥离皮肤，还暴露剩余的右侧^第 4和^第 5 ^个乳腺腺体。
4. 消除剩余的乳腺组织，并检查我吨通过苏木精和伊红（H＆E）染色（ 补充 图1）评估串行切片福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE）组织，以排除原发性肿瘤再生长。
5. 为了清除肺，用剪刀打开隔膜的腹壁，然后通过切开腹主动脉来安乐死动物，在灌注肺之前排出血液（ 图2B -2C ）。
6. 从腹部方法切割隔膜，确保避免肺和心脏。然后，通过切穿肋骨的侧面暴露胸部（ 图2D ）。
7. 在20 mL注射器上使用23号针头，通过心脏右心室灌注〜5.0 mL DPBS（〜10 mL / min）的肺，直到肺完全变白（ 图2E -2F ）。立即切断主体的心脏因此，血液不会重新灌注到肺部。
8. 对于待组织的肺组织进行组织病理学评估，使用23号针头（ 图2G - 2H ），将4℃下的〜1.0mL 10％福尔马林注射到暴露的气管斜面侧朝向肺。一旦肺完全扩张并充满固定剂，停止注射（ 图2I ）。
9. 根据标准组织病理学程序，从气管切除肺叶，并将中性缓冲福尔马林的肺组织固定在随后的石蜡包埋或OCT-冷冻培养基中。
10. 通过FFPE肺组织的连续切片定量评估肺转移负荷，并通过H＆E染色（ 图1B ）评估切片切片（100μm，十三个切片）。

结果

从衍生自MMTV-PyMT小鼠的原发乳腺肿瘤中接受1×10 ^6个细胞的大于75％的受体小鼠在38-60天内开发尺寸为172至450mm ^3的单个乳腺腺癌（数据未显示）。符合随机分组的小鼠然后在手术切除原发性肿瘤后纳入研究组（ 图1C ）。在不到2％的原发肿瘤手术切除的小鼠中鉴定到原发性肿瘤再生长（ 补充 图1 ）。?...

讨论

修改和故障排除:

当钝器从腹壁解剖肿瘤时，肿瘤可能仍然粘附在腹壁上。在<5％注射肿瘤的小鼠中观察到这种情况（数据未显示）。对于具有粘附于腹壁的肿瘤的小鼠，应当对小鼠进行安乐死，因为切除难度而没有原发性肿瘤再生长。

模型/技术的限制:

除了肺外，其他研究者报告除了肺外，分布在肝脏?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800