כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של<em&gt; דה נובו</em&gt; גרורות סרטן החלב

Summary

מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג'ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג'ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך את היעילות להשפיע על גרורות בעבר ריאתי seeded.

Abstract

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introduction

לנשים בצפון אמריקה יש סיכון של 12% לכל החיים לפתח סרטן שד ² ; רוב האנשים האלה יהיו גידולים ראשוניים הוסרו באמצעות ניתוח, ובהתאם לסוג הסרטן, לאחר מכן יקבלו טיפול ממוקד, אנדוקריני, כימותרפיה ו / או הקרנות בסביבה אדג'ובנטית ³ . דוגמאות לכך כוללות נשים המאובחנות בסרטן חיובי של קולטן הורמון המקבל טיפולים נגד אסטרוגן ונשים עם גידולים חיוביים ל- HER2 המקבלים טיפולים המבוססים על HER2 עם הקרנות / כימותרפיה, בעוד שאף טיפולים ממוקדים אינם זמינים עדיין לגידולים שליליים שליליים ³ . למרות ההתקדמות בקרינה, כימותרפיה, טיפולים מותאמים אישית והורמונים המשלימים כריתה כירורגית, המחלה חוזרת ב -30% -70% מהנשים המאובחנות עם מחלת שלב II או III ⁴ , מכיוון שהטיפולים אינם יעילים במידה רבה במיגור מחלות גרורות באיברים מרוחקים, כולל ריאה, עצם, bגשם ו / או כבד ⁵ . זה משמעותי במיוחד בהתחשב בכך שכאשר מחלת גרורות מתרחשת בהעדר גידול מחודש של הגידול, משמעות הדבר היא שתאים ממאירים מופצים היו קיימים כבר באיברים משניים בזמן הניתוח הסופי. לכן טיפולים מסוגלים לחסל או להאט את הצמיחה של גידולים גרורתיים נדרשים בדחיפות.

בעוד מודלים העכבר נובו של קרצינוגנזה החלב כבר אינפורמטיבי להפליא מנגנוני חשיפת ויסות התקדמות ניאופלסטית ¹ , מודלים קיימים גם מספר מגבלות. אחד מהם הוא העובדה כי דה novo מודלים מהונדס בדרך כלל לפתח גידולים ראשוניים בבלוטות החלב מרובים, שבו הגידול הראשוני נטל מגבלות משך הלימודים. בעוד שתא הגידול העיקרי בתאי הזרע הגרורתי עשוי להתרחש מוקדם בהתקדמות ניאופלסטית במודלים אלו, התפתחות גלויה של גידולים גרמניים מתרחשת מאוחר,N את מודל העכבר ואת רקע זן, הוא לעתים קרובות חלקית החדירה ¹ . זה עוד מגביל את התועלת של מודלים של נובו לגילוי של מולקולות המסדירות גרורות באיברים משניים, וכן להערכת יעילות פרה קלינית של טיפולים בסביבה adjuvant.

כדי לעקוף את המגבלות הללו, פיתחנו מודל נוטו autochthonous של גרורות קרצינומה החלב לריאות. אמהות מהונדסות מהונדס ( כלומר , MMTV-PyMT על רקע FVB / n זן למחקרים המתוארים כאן) הנושא בשלב מאוחר של גידולי החלב novo הם בגילאי ~ 100 ימים ⁶ , ובנקודה שבה גידולים העיקריים שלהם הם resected כירורגי ו ניתק באופן אנזימטי לתוך תא יחיד השעיות. השעיות (1 x 10 ⁶ תאים) הם בתורו autantotopically explanted לתוך 6-7 בן מקבלי נקבה עכברים syngeneic, שבו אחד גידולי החלב העיקרית לפתח על 38-60 יום תקופה ( איור 1 א). בגודל של גידול מוגדר (172 עד 450 מ"מ ³ ), עכברים מקבלים מורדמים וגידולים ראשוניים הם resected כירורגי כך לצמיחה מחודשת של הגידול באתר כירורגית ממוזער, עולה בקנה אחד עם ניתוח בנשים ( איור משלים 1 ). על רקע FVB / n זן, עכברים לפתח foci גרורתי היסטולוגית הריאות עם החדירה 45% על ידי ~ 115 ימים לאחר הניתוח ( איור 1 ב ). עם זמן חביון ממושך זה של גידול גידולי גרורתי, המודל ממוקם באופן ייחודי עבור מתן טיפול אדג'ובנטי, וכן להבהרה והערכת ביולוגיה בסיסית המשפיעים על התקדמות גרורת בעקבות הסרה כירורגית של גידולים ראשוניים.

Protocol

בעלי חיים המשמשים בפרוטוקול הבא מכוסים על ידי אורגון הבריאות והמדע של אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC), אשר נועד להיות תואם את תקנות רווחת בעלי חיים מדיניות בריאות הציבור (PHS) מדיניות.

תחזוקה של תנאים סטריליים: מכשירים מעוקרים יש להשתמש בין העכברים, יש לנגב נקי עם גזה סטרילית, שטופים PBS ואחריו עיקור עם אתנול 70% מחטא במשך 15 דקות לפחות. כובע כירורגי, מסכת פנים, חלוק, כפפות צריך להיות משוחק עבור ניתוחים הישרדות. הכנה טרום אופרטיבית של החיה עבור ניתוחים הישרדות כלול בפרוטוקול הבא. עיין בטבלה 1 עבור רשימה של ריאגנטים וציוד.

1. בידוד והכנת תרחישי תא בודד מגידולי החלב הראשוניים

1. להרדים נקבה התורם 100 יום מהונדס MMTV-PyMT (FVB / N) עכברים ולשמור תחת cעל ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה. ודא כי העכבר הוא הרדים כראוי עם רפלקס הרגל לקוי הרגל.
2. בסביבה סטרילית, לגזור את גידולי החלב העיקרי של 100 יום מהונדס נקבה נקבה MMTV-PyMT (FVB / N) עכברים על ידי הפרדת הגידול החלב מן העור מעל הרקמות השומן שמסביב ו / או בלוטות לימפה באמצעות מספריים סטריליים. להרדים את העכברים הרדים על ידי נקע בצוואר הרחם.
3. במספריים סטריליים או באזמל מנתחים גידולים ראשוניים באופן ידני לחתיכות קטנות (~ 1.0 מ"מ ³ ). מקום חתיכות הגידול ב 3.0 מ"ג / מ"ל ​​collagenase A ו 4.0 U / מ"ל ​​DNase אני מומס DMEM. השתמש ~ 10 מ"ל של המדיום העיכול לעיל לכל 1.0 ס"מ קוטר הגידול.
   1. בצע עיכול בקבוק סטרילי 25 מ"ל עם סט מערבל סטרילי בסל"ד 125 ~ ו 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
4. עצור את העיכול על ידי הוספת בסרום עוברי בסרום (FBS) לדילול הסופי של 10% ומניחים את התערובת כולה על wוקרח שבו הוא מתוחזק.
5. מסנן את ההשעיה הגידול מתעכל באמצעות מסננת ניילון 0.7 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל וזורקים כל גידול שנותר מסננת. צנטריפוגה supernatant ב XG 300 ב 4 ° C.
6. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל DMEM לכל 1.0 ס"מ הגידול מחדש לסנן באמצעות מסננת ניילון 0.7 מיקרומטר. ספירת הריכוז התא, ואז צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 ° C.
7. Resuspend גלולה ב 10% דימתיל sulfoxide עם 90% FBS בריכוז של 2 x 10 ⁷ תאים חיים / מ"ל. חנות השעיות תא בודד של הגידול הראשוני כולו ב -80 מעלות צלזיוס.

2. הזרקת אורתופטית של גידול החלב

1. חלקית להפשיר קפוא המתלים הגידול הראשוני ב 37 ° C עד גלולה קפואה ניתן לשחרר מן הצינור cryogenic לתוך DMM 20 מ"ל לספור את התאים. צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס תאים resuspend ב 1: 1 DMEM: גורם הצמיחה מופחת solobilized המרתף הממברנה הכנהXtracted מ Engelbreth-Holm- נחיל (EHS) סרקומה העכבר בריכוז של 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל ​​(ראה טבלה של חומרים ).
2. מניחים את הרדיד הנמען הנשי סיניגני העכבר בצד הגחון מעלה ולשמור תחת הרגעה רציפה על ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה.
3. לעקר את הזכות הזרקה 4 בלוטת חלב באתר באמצעות אתנול 70% Aerosolized וליישם פולי (vinylpyrrolidone) - יוד עם ספוגית כותנה סטרילית.
4. להזריק 100 μL (1 x 10 ⁶ תאים חיים מן המתלים הקפואים הגידול הראשוני) שפוע בצד כלפי מעלה לתוך בלוטת החלב ימין לא ברור של 6 עד 10 בשבוע FVB / N העכבר בשבוע באמצעות מזרק 29 G 0.3 מ"ל אינסולין.

3. כריתה כירורגית של גידול חזה אורתופטי

1. 38-60 ימים לאחר הזרקת תאים סרטניים, עכברים מורדמים לא מציגים כרכים גידול אורטוטופיים הנעים בין 172 ל 450 מ"מ ³ בנפח [אורך x (רוחב ² ) / 2] (כ 75% של עכברים מוזרק).
2. מניחים עכברים מורדמים הצגת גודל הגידול הנכון הגחון בצד תחת הרדמה מתמשכת על ידי מתן 2% isoflurane באמצעות מסכה הרדמה לאשר את העכבר הוא הרדים כראוי עם רפלקס הרגל לקוי הרגל. החל משחה וטרינר לעיניים למניעת יובש בזמן תחת סדיישן.
3. ריסוס אתנול 70% לעקר את האזור כירורגית סביב הגידול הראשוני, ולאחר מכן להחיל פולי (vinylpyrrolidone) - יוד עם צמר גפן סטרילי.
   הערה: הסרת שיער באתר הניתוח גרמה לעורקים ו / או לזיהומים בעכברים של 5%, ולכן לא נכללה בשלב זה (נתונים לא מוצגים).
4. כפי שמוצג בתרשים 1C , לעשות חתך ראשוני העור באמצעות מספריים קהה המדיאלי הזנב לגידול.
5. לאחר מכן, לעשות כריתה מעולה של העור ( איור 1C ) המדיאלי לגידול. שים לב לצורך לצרוב כל כלי הדםהעורכים את הגידול הממוקם על העור לפני הארכת החתך.
6. המשך חתך העור לרוחב (האחורי לגידול), ולאחר מכן לבצע חתך העור מעולה (לרוחב הגידול), כריתה המדיאלי (עדיף על הגידול) ( איור 1 ג ).
7. לאחר העור כבר נכרת סביב סביב הגידול ( איור 1 ג ), להרים את העור המחובר לגידול באמצעות מלקחיים בעוד בוטה לנתח את הגידול הרחק את שרירי דופן דופן הבטן ולשמור על בלוטות החלב ללא פגע.
8. זהה (על ידי דיסקציה קהה) ולליבון כלי גדול פועל באמצעות בלוטות החלב 4 ^וה 5 ^th.
9. והבלו כמחצית בלוטות החלב 4 ^וה 5 ^th באתר צריבה לשחרר את הגידול, בעור שמעל, ומגזרי של בלוטות החלב (איור 1C).
10. במקרה של דימום, לזהות דימום פעילכלי ומיד לצרוב אותם. אם יותר מ 250 μL של דם הוא איבד, להוציא את העכבר מן המחקר להרדים אותו.
11. סגור אתרי כריתה עם קליפים הפצע באמצעות applier קליפ הפצע ( איור 1C ).
    הערה: הסר את קליפי הפצע 10 ימים לאחר הניתוח עם מסיר קליפ הפצע.
12. ניהול מלוחים סטרילי חם תת עורית (4% ממשקל הגוף של החיה) ולשמור על החיה חם עם מנורת חום. בדוק את החיות כל 5-10 דקות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה.
    הערה: מינון של bupivacaine או לידוקאין העלה תמותה לאחר הניתוח (נתונים לא מוצגים). עכברים אשר הראו סימנים של כאב (בטן, לא מוכן לזוז, כישלון החתן) 1 שעות לאחר הניתוח היו מורדמים.
    1. לאחר העכבר יש התאושש לחלוטין, להחזיר אותו לחברה של עכברים אחרים.

4. בידוד ועיבוד של דם וריאות עבור זרימת cytometry ו היסטולוגיה

1. ב endpoints המחקר, להכין עכברים להערכות שונות histopathologic אם תרצה. 90 דקות לפני המתת חסד, לתת לכל עכבר הזרקה intraperitoneal של bromodeoxyuridine (BrdU, 50 מיקרוגרם / גרם משקל העכבר) בריכוז של 6.25 מיקרוגרם / μL ב 1x PBS.
   הערה: מלאי קפוא של bromodeoxyuridine מומס משמשים בתוך חודש לאחר ההכנה.
2. 10 דקות לפני המתת חסד, עם העכבר הרדים, לאסוף דם retroorbital (> 500 μL) באמצעות צינורות נימי heparinized, ולאחר מכן להעביר צינורות מצופים dipotassium EDTA שנערך על הקרח.
3. כדי להסיר ריאות ורקמות חלב נותרות, לעשות חתך קו אמצע עם מספריים מן הבטן התחתונה אל הפה כדי לחשוף את החזה ואת החללים הצפק (איור 2 א), וכן לקלף את העור רוחבי כדי גם לחשוף את 4 ^וה 5 הנותרים התקינים ^ה החלב בְּלוּטוֹת הַרוֹק.
4. הבלו את רקמת הבלוטות החלב הנותרות ולבחון אלא לשלול לצמיחה מחודשת הגידול הראשוני על ידי הערכת סידורי מחולק פורמלין קבוע פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה על ידי hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים ( איור משלים 1 ).
5. כדי להסיר את הריאות, לפתוח את דופן הבטן כדי הסרעפת עם מספריים, ולאחר מכן להרדים את החיה על ידי חיתוך אבי העורקים הבטן לניקוז דם לפני זלוף של הריאות ( איור 2B -2C ).
6. חותכים את הסרעפת לאורך כלוב הצלעות מתוך גישה הבטן הקפד להימנע הריאה והלב. לאחר מכן, לחשוף את החזה על ידי חיתוך דרך הצדדים לרוחב של כלוב הצלעות ( איור 2 ד ).
7. באמצעות מחט 23 מד על מזרק 20 מ"ל, ריאות perfuse עם ~ 5.0 מ"ל DPBS (~ 10 מ"ל / דקה) דרך החדר הימני של הלב עד הריאות להפוך לגמרי לבן ( איור 2E -2F ). מיד לחתוך את הלב מן הספינה הראשיתכל כך דם לא חוזר אל הריאה.
8. עבור רקמת הריאה להיות קבוע ומעובד עבור הערכות histopathologic, להזריק ~ 1.0 מ"ל פורמלין 10% ב 4 מעלות צלזיוס בצד חשוף trachea חשוף כלפי מעלה כלפי הריאות באמצעות מחט 23 מד ( איור 2G - 2H ). להפסיק הזרקת הריאות פעם מורחבות לחלוטין ומלא מקבע ( איור 2I ).
9. בלוטות ריאות בלו מ קנה הנשימה, ואת רקמת תיקון רקמת ריאות נייטרלי שנאגרו פורמלין עבור הטבעה פרפין הבאים או בינוני אוקטובר הקפאה, לכל הליכים היסטופתיות סטנדרטיות.
10. באופן כמותי להעריך נטל גרתי הריאות על ידי חתך סדרתי של רקמת הריאות FFPE ולהעריך קטעים microtome (100 מיקרומטר, שלושה עשר סעיפים), על ידי H & E מכתים ( איור 1 ב ).

תוצאות

יותר מ 75% מהעכברים המקבלים שקיבלו 1 x 10 ⁶ תאים מגידולי החלב העיקריים שנגזרו מעכברי MMTV-PyMT, פיתחו אדנוקרצינומות חד-פעמיות בגודל של 172 עד 450 מ"מ ³ בתוך 38-60 ימים (נתונים לא מוצגים). עכברים זכאים אקראיים נרשמות מכן לקבוצות מחקר לאחר כריתה כירורגי...

Discussion

שינויים ופתרון בעיות:

כאשר בוטה לנתח את הגידול במרחק של דופן הבטן, הגידול עשוי להישאר דבקים בדופן הבטן. זה נצפתה <5% של עכברים מוזרק גידול (נתונים לא מוצג). עבור עכברים עם גידולים הדבקים בקיר הבטן, העכבר צריך להיות מורדמים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800