전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론<em&gt; 드 노보</em&gt; 유방암 전이

요약

유방암 전이를 목표로하는 보조 요법을 평가하는 전임상 모델이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 de novo 폐 유방 선암 전이의 마우스 모델을 개발했는데, adjuvant setting (원발 종양의 수술 후 절제술)에서 투여 된 치료법은 이전에 파종 된 폐 전이에 영향을 미치는 효능을 평가할 수 있습니다.

초록

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

서문

북미의 여성은 ^{유방암이 개발의} ~ 12 %의 평생 위험이; 이 환자의 대다수는 수술을 통해 제거 된 원발 종양을 가지게되며, 암 부속 유형에 따라 보조제 세팅 ³ 에서 표적, 내분비, 화학 요법 및 / 또는 방사선 치료를 받게됩니다. 예를 들어, 항 - 에스트로겐 요법을받는 호르몬 수용체 양성 암 및 방사선 / 화학 요법으로 HER2 타겟 요법을받는 HER2 양성 종양이있는 여성으로 진단 된 여성은 삼중 음성 종양 ^3에 대한 표적 치료법이 아직 없습니다. 치료는 원격 장기에 전이 된 질병 퇴치에 크게 효과가 같은 수술 적 절제를 보완 방사선, 화학 요법, 개인 및 호르몬 기반 치료의 발전에도 불구하고, 질병을 포함, 단계 II 또는 III 질환 ⁴ 진단을 여성의 30~70%에 재발 폐, 뼈, b비 및 / 또는 간 ⁵ . 이는 원발성 종양 재성장이없는 상태에서 전이성 질환이 발생했을 때 확진 된 수술 당시 파종 된 악성 세포가 이차 기관에 이미 존재했을 가능성이 높다는 것을 감안할 때 특히 중요합니다. 따라서 전이성 종양을 박멸하거나 성장을 지연시킬 수있는 치료법이 시급히 필요합니다.

유방 발암의 드 노보 마우스 모델, 종양 진행 ^{한 조절} 메커니즘을 드러내는 현저 정보되었지만 기존 모델은 몇 가지 제한이있다. 이들 중 하나는 de novo 형질 전환 모델이 일반적으로 원발성 종양 부담이 연구 기간을 제한하는 다중 유방 ​​땀 샘에서 원발 종양을 발병한다는 사실입니다. 일차 종양 세포 탈출과 전이성 파종이이 모델에서 종양 진행의 초기에 일어날 가능성이 있지만, 전이성 종양의 솔직한 발달은 늦게 발생하며,n 마우스 모델 및 변형 배경은 종종 부분적으로 침투합니다 ¹ . 이것은 이차 장기에서의 전이를 조절하는 분자 발견을위한 de novo 모델의 유용성을 제한하고, 보조제 환경에서 치료제의 전임상 효능을 평가하기위한 것이다.

이러한 한계를 피하기 위해 우리는 폐에 유방암 종양 전이의 자동 신생 모델을 개발했습니다. 부모의 형질 전환 여성 (즉, MMTV-PyMT은 여기에 기술 연구에 대한 FVB / N 변형 배경에) 말기 베어링 드 노보 유방암이되는 자신의 차 종양은 외과 적 절제 및 효소로 분해되어 가리 ~ 백일 ⁶ 세되는 단일 세포 현탁액. 일시 정지 (1 x 10 ⁶ 세포)는 차례로 동종 이형 유방 종양이 38-60 일의 기간 동안 발병하는 6-7 주령의 수혜자 동족 ​​암컷 생쥐 ( 그림 1A). 정의 된 종양 크기 (172에서 450mm ³ )에서 수혜자 마우스를 마취시키고 원발 종양을 수술 부위에서 종양 재성장이 최소화되도록 외과 적으로 절제하여 여성의 수술과 일치시킵니다 ( 보충 그림 1 ). FVB / n 균주 배경에서 마우스는 수술 후 ~ 115 일까지 45 %의 침투율을 보이는 폐에서 조직 학적으로 검출 가능한 전이 초점을 발달시킵니다 ( 그림 1B ). 이 전이성 종양 성장 지연으로이 모델은 보조 요법 전달, 원발성 종양의 외과 적 제거 후 전이성 진행에 영향을 미치는 기초 생물학을 밝히고 평가하기위한 고유 한 위치에 있습니다.

프로토콜

다음 프로토콜에 사용 된 동물은 동물 복지 법 규정 및 보건 서비스 (PHS) 정책을 준수하도록 고안된 오리건 건강 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 적용을받습니다.

멸균 조건의 유지 관리 : 멸균 된 도구를 마우스 사이에서 사용해야하며 멸균 거즈로 깨끗이 닦고 PBS로 헹구어 낸 다음 소독제 70 % 에탄올로 최소 15 분 동안 멸균해야합니다. 생존 수술을 위해서는 수술 용 모자, 안면 마스크, 가운 및 장갑을 착용해야합니다. 생존 수술을위한 동물의 수술 전 준비는 다음 프로토콜에 포함되어 있습니다. 시약 및 장비 목록은 표 1을 참조하십시오.

원발성 유방 종양으로부터 단일 세포 현탁액의 분리 및 제조

1. Donative female 100 일 된 트랜스 제닉 MMTV-PyMT (FVB / n) 마우스를 마취시키고 c마취 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 지속적인 진정 작용. 발 핀치 반사가 없으면 마우스가 올바르게 마취되었는지 확인하십시오.
2. 멸균 설정에서 멸균 가위를 사용하여 피부와 주변 지방 조직 및 / 또는 림프절에서 유방 종양을 분리하여 100 일 된 트랜스 제닉 암 MMTV-PyMT (FVB / n) 생쥐의 원발성 유방 종양을 절제하십시오. 자궁 경관 탈구로 마취 쥐를 안락사.
3. 멸균 가위 또는 메스를 사용하여 원발 종양을 수작업으로 작은 조각 (~ 1.0 mm ³ )으로 채 웁니다. 종양 조각을 3.0 mg / mL collagenase A 및 4.0 U / mL DNase I에 DMEM에 용해시킨다. 직경 1.0 cm의 종양 당 ~ 10 mL의 위의 소화 배지를 사용하십시오.
   1. ~ 125 RPM 및 37 ° C에서 40 분 동안 멸균 교반 막대를 사용하여 멸균 25 mL 병에서 소화를 수행하십시오.
4. 태아 소 혈청 (FBS)을 최종 희석액 10 %에 첨가하여 소화를 중지하고 전체 혼합물을 w얼음이 유지됩니다.
5. 0.7 ML 나일론 여과기를 통해 소화 종양 현탁액을 50 ML 원뿔 튜브로 필터링하고 여과기에 남아있는 종양을 폐기하십시오. 4 ℃에서 300xg로 뜨는 원심 분리기.
6. 1.0 cm 종양 당 10 ML DMEM에 펠렛을 Resuspend하고 0.7 μm의 나일론 여과기를 통해 다시 필터링. 셀 농도를 세고 4 x 300xg로 원심 분리한다.
7. 2 × 10 ⁷ 살아있는 세포 / ML의 농도 90 % FBS와 10 % dimethyl sulfoxide에 Resuspend 펠렛. -80 ° C에서 전체 원발 종양의 단일 세포 현탁액을 저장하십시오.

2. 유방 종양의 정위 주사

1. 냉동 펠렛이 극저온 튜브에서 20 mL DMEM으로 방출되어 세포 수를 계산할 때까지 37 ° C에서 1 차 종양 현탁액을 부분적으로 해동합니다. 4 X 300 XG에서 원심 분리기와 1 : 1 DMEM에 resuspend 세포 : 성장 요소 - 감소 solubilized 지하 막 준비 전자1 × ¹⁰⁷ 세포의 농도 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 마우스 육종에서 xtracted / ㎖는 (재료의 도표 참조).
2. 마취 된 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 마취 된 여성 동종 마우스의 복부 측면을 위로 놓고 계속 진정 작용을 유지하십시오.
3. 에어로졸 70 % 에탄올을 사용하여 오른쪽 제 4 유선 선 주사 부위를 살균하고 무균 면봉으로 폴리 (비닐 피 롤리 돈) - 요오드를 적용합니다.
4. 29 G 0.3 ML 인슐린 주사기를 사용하여 6 ~ 10 주 된 여성 FVB / n 마우스의 깨끗한 오른쪽 4 번째 유선에 100 μL (냉동 원발 종양 현탁액에서 1 x 10 ⁶ 살아있는 세포) 베벨 사이드를 주사.

3. 정위 유방 종양의 외과 적 절제술

1. 종양 세포 주입 다음 38-60일는 쥐 부피 ^3mm 450-172 사이 [길이 x 징 동소 종양 부피를 나타내지 않는 안락사 (폭 ²
2. 마취 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 지속적인 진정하에 적절한 종양 크기 복부 측면을 표시 마취 마우스를 배치하고 마우스가 결석 발 핀치 반사와 함께 적절하게 마취되었는지 확인합니다. 진정 작용이있는 동안 건조 방지를 위해 수의사에게 눈물을 채우십시오.
3. 원발 종양을 둘러싼 수술 부위를 멸균하기 위해 70 % 에탄올을 스프레이 한 다음 멸균 된 면봉으로 폴리 (비닐 피 롤리 돈) -Iodine을 바르십시오.
   참고 : 외과 수술 부위의 제모는 ~ 5 % 마우스의 피부 탈출 및 / 또는 감염을 유발 했으므로이 단계에서 제외되었습니다 (데이터는 표시되지 않음).
4. 그림 1C에 나타난 것처럼, 종양의 중앙 - 꼬리 부분에 무딘 가위를 사용하여 초기 피부 절개를하십시오.
5. 다음으로, 종양의 중간에있는 피부 ( 그림 1C )의 우수한 절제를하십시오. 모든 혈관계를 소작 할 필요성에주의하십시오.절개를 연장하기 전에 피부에있는 종양을 eding.
6. 옆으로 (종양의 후방) 피부 절개를 계속 한 다음 탁월한 피부 절제 (종양 측면)와 내과 적 절제 (종양보다 우수) ( 그림 1C )를하십시오.
7. 피부가 종양 주위로 절제 된 후 ( 그림 1C ) 종양을 복부 벽 근육에서 멀리 해부하고 유선을 손상시키지 않으면 서 겸자를 사용하여 종양에 붙어있는 피부를 들어 올립니다.
8. 4 ^번째 와 5 ^번째 유방 땀샘을 관통하는 대형 혈관을 (무딘 절개로) 확인하고 소작하십시오.
9. 소작 부위에서 4 ^번째 및 5 ^번째 유방 땀샘의 약 절반을 잘라내어 종양, 피부, 그리고 유선의 일부분을 제거합니다 ( 그림 1C ).
10. 출혈이있을 경우, 출혈을 적극적으로 식별하십시오.즉시 그들을 소작하십시오. 혈액 250 μL 이상이 손실되면 마우스를 연구에서 제외하고 안락사시킵니다.
11. 상처 클립 applier ( 그림 1C )를 사용하여 상처 클립과 excision 사이트를 닫습니다.
    참고 : 상처 클립 제거제로 수술 10 일 후 상처 클립을 제거하십시오.
12. 피하 (동물의 체중의 4 %) 따뜻한 멸균 식염수를 관리하고 열 램프로 동물을 따뜻하게 유지. 마취에서 회복되는 동안 매 5 ~ 10 분마다 동물을 확인하십시오.
    주 : bupivacaine 또는 lidocaine 투여는 수술 후 사망률을 증가시켰다 (데이터는 나타내지 않음). 수술 후 1 시간 동안 통증의 징후를 보인 마우스 (사냥감, 움직이지 않으려 고 함, 손질에 실패 함)를 안락사시켰다.
    1. 마우스가 완전히 회복되면 다른 마우스 회사에 반환하십시오.

4. 유동 세포 계측법 및 조직학을위한 혈액 및 폐의 분리 및 처리

1. 연구 종점에서 원하는 경우 다양한 조직 병리학 적 평가를 위해 마우스를 준비하십시오. 안락사하기 90 분 전에 각 마우스에게 bromodeoxyuridine (BrdU, 50 μg / g 마우스 체중)을 1 x PBS에 6.25 μg / μL 농도로 복강 내 주사한다.
   참고 : 용해 된 bromodeoxyuridine의 냉동 보관은 준비 후 1 개월 이내에 사용됩니다.
2. 마취 된 마우스로 안락사하기 10 분 전에 헤파린 처리 된 모세관을 사용하여 후각 유혈 (> 500 μL)을 수집 한 후 얼음에 낀 EDT로 코팅 된 튜브로 옮긴다.
3. 폐와 남아있는 유방 조직을 제거하기 위해 가슴 아래와 복강을 드러내 기 위해 하복부에서 입으로 가위로 정중선 절개를하고 ( 그림 2A ) 피부를 옆으로 떼어 내고 나머지 4 ^번째 와 5 ^번째 유방을 노출시킵니다 땀샘.
4. 나머지 유선 조직을 잘라 내고hematoxylin과 eosin (H & E) 염색에 의한 연속 절편 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직을 평가하여 원발 종양의 재성장을 배제 하였다 ( 보충 그림 1 ).
5. 폐를 제거하려면 가위로 횡격막에 복벽을 열고 복부 대동맥을 절단하여 폐를 관류시키기 전에 혈액을 배출하여 동물을 안락사시킵니다 ( 그림 2B -2C ).
6. 복부 접근법에서 흉곽을 따라 횡경막을 잘라 폐와 심장을 피하십시오. 그런 다음, 흉곽의 측면을 절단하여 흉부를 노출시킵니다 ( 그림 2D ).
7. 20 ML 주사기에 23 게이지 바늘을 사용하여 폐가 완전히 흰색 ( 그림 2E -2F )로 변할 때까지 심장의 오른쪽 심실을 통해 ~ 5.0 ML DPBS (~ 10 ML / 분)와 폐를 perfuse. 즉시 주요 배에서 심장을 자른다.그래서 피가 폐로 다시 퍼지지 않습니다.
8. 폐 조직을 고정하고 조직 병리학 적 평가를 위해 4-C에서 ~ 1.0 mL의 10 % 포르말린을 23 게이지 바늘 ( 그림 2G - 2H )을 사용하여 폐쪽으로 노출 된 호흡 경사 측면으로 주사합니다. 일단 폐가 완전히 팽창되고 정착액으로 채워지면 주입을 중단하십시오 ( 그림 2I ).
9. 기관에서 폐엽을 제거하고 표준 조직 병리학 적 절차에 따라 중성 완충 포르말린에서 폐 조직을 고정하여 후속 파라핀 매입 또는 OCT 동결 매질을 만듭니다.
10. FFPE 폐 조직의 연속 절편을 통해 폐의 전이성 부하를 정량적으로 평가하고 H & E 염색 ( 그림 1B )을 통해 마이크로톰 섹션 (100 μm, 13 개 섹션)을 평가합니다.

결과

그레이터 MMTV-PyMT 마우스 유래의 기본 유방암에서 1 × ¹⁰⁶ 세포를 수신받는 마우스의 75 % 이상, 172에서 450mm ³ 38-60 일 이내의 크기에 이르는 단일 유방 선암 개발 (데이터는 보이지 않음). 무작위 추출에 적합한 마우스는 그림 과 같이 원발 종양의 외과 적 절제 후 연구 그룹에 등록됩니다 ( 그림 1C ). 원발 종양의 ?...

토론

수정 및 문제 해결 :

복부 벽에서 종양을 절제 할 때 종양이 복부 벽에 부착 된 채로 남아있을 수 있습니다. 이것은 종양이 주입 된 마우스의 5 % 미만에서 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 복벽에 부착 된 종양이있는 마우스의 경우 원발 종양 재성장 없이는 절제가 어렵 기 때문에 마우스를 안락사해야합니다.

모델 / 기술의 한계 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800