Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

Özet

Meme kanseri metastazını hedef alan adjuvan tedaviyi değerlendiren klinik öncesi modeller eksiktir. Buna değinmek için, de novo pulmoner meme adenokarsinom metastazına ait bir fare modeli geliştirdik, burada adjuvan ortamında (primer tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyonu) uygulanan terapiler önceden tohumlanmış pulmoner metastazları etkilemek için etkinlik açısından değerlendirilebilir.

Özet

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Giriş

Kuzey Amerika'daki kadınların yaşam boyu% 12 oranında meme kanseri riski ^{2 vardır} ; Bu kişilerin çoğunluğunun ameliyat yoluyla primer tümörler çıkarılacağı ve kanser alt tipine bağlı olarak adjuvan ortamında hedefe bağlı, endokrin, kemo ve / veya radyoterapi alacağı ³ . Örnekler, anti-östrojen terapileri alan hormon reseptörü pozitif kanserler tanısı konan kadınlar ve radyasyon / kemoterapi ile HER2 hedefli terapiler alan HER2 pozitif tümörleri olan kadınlar olmakla birlikte, üçlü negatif tümörler için henüz hedeflenmiş tedaviler mevcut değildir ³ . Radyasyon, kemoterapi, kişiselleştirilmiş ve hormonal esaslı cerrahi rezeksiyon eklemelerindeki ilerlemelere rağmen, evre II veya III hastalık ⁴ olarak teşhis edilen kadınların% 30-70'inde hastalık tekrar eder; çünkü terapiler uzak organlarda metastatik hastalığın ortadan kaldırılmasında büyük ölçüde etkisizdir; Akciğer, kemik, bYağmur ve / veya karaciğer ⁵ . Metastatik hastalık primer tümör yeniden büyümesinin olmaması durumunda ortaya çıktığı zaman bu, özellikle önemli bir konudur; bu da, kesin ameliyat sırasında, dissemine malign hücrelerin muhtemelen ikincil organlarda zaten mevcut olduğunu ima eder. Bu nedenle, metastatik tümörlerin yok olmasını veya yavaş büyümesini sağlayabilen terapilere acilen ihtiyaç vardır.

Meme karsinogenezisin de novo fare modelleri, neoplastik ilerlemesinin ¹ düzenleyen mekanizmaların açığa dikkat çekecek derecede bilgilendirici olmuş olmakla mevcut modeller ayrıca çeşitli sınırlamalara sahiptir. Bunlardan biri, de novo transgenik modellerin tipik olarak birden fazla meme bezi içerisinde primer tümörler geliştirdiği gerçeğidir; burada primer tümör yükü çalışma sürelerini sınırlar. Primer tümör hücresi kaçışı ve metastatik tohumlama, muhtemelen bu modellerde neoplastik progresyonun erken döneminde ortaya çıkarken, metastatik tümörlerin açık gelişimi geç ortaya çıkar veFare modeli ve gerinim arka planı, çoğunlukla kısmen penetrantır ¹ . Bu ayrıca, ikincil organlarda metastazı düzenleyen moleküllerin keşfi için de novo modellerin kullanımını sınırlar ve adjuvan ortamında önleyici etkinliğin değerlendirilmesi için sınırlandırılır.

Bu kısıtlamaları ortadan kaldırmak için, akciğerlere yönelik meme kanseri metastazının de novo otonom modeli geliştirdik. Son evre de novo meme tümörleri taşıyan ebeveyn transgenik dişiler (diğer bir deyişle , burada açıklanan çalışmalar için FVB / n suşu zemininde MMTV-PyMT) yaklaşık 100 gün ⁶ yaşlandırılır ve bu noktada primer tümörler cerrahi olarak rezeke edilir ve enzimatik olarak Tek hücreli süspansiyonlar. Süspansiyonlar (1 x 10 ⁶ hücre) sırayla ortotopik olarak 6-7 haftalık alıcı eş merkezli dişi farelere eksplane edilir ve burada tekli primer meme tümörleri 38 ila 60 günlük süre boyunca gelişir ( Şekil 1A). Tayin edilmiş bir tümör boyutu olarak (172, 450 ila ³ mm), alıcı farelere anestezi yapılır ve primer tümörler cerrahi cerrahi alanda tümörün yeniden büyüdüğü kadınlarda cerrahi (Ek Şekil 1) ile uyumlu, en aza inecek şekildedir çıkartılmaktadır. Fareler, FVB / n suşu zemininde, ameliyat sonrası ~ 115 gün boyunca% 45 penetransli akciğerlerde histolojik olarak saptanabilir metastatik odak gelişir ( Şekil 1B ). Metastatik tümör büyümesinin uzatılmış gecikmesi ile model, adjuvan tedavi sunumu için ve primer tümörlerin cerrahi olarak çıkarılmasını takiben metastatik ilerlemeyi etkileyen biyolojiyi aydınlatmak ve değerlendirmek için benzersiz bir şekilde konumlandırılmıştır.

Protokol

Aşağıdaki protokolde kullanılan hayvanlar, Hayvan Refahı Yasası düzenlemelerine ve Halk Sağlığı Hizmeti (PHS) Politikasına uyumlu olacak şekilde tasarlanan Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından kapsanmaktadır.

Steril koşulların bakımı: Sterilize edilmiş aletler kullanılmalı ve fareler arasında steril gazlı bezle silinmeli, PBS içinde durulanır ve ardından en az 15 dakika dezenfekte edici% 70 etanolle sterilize edilmelidir. Hayatta kalma ameliyatları için cerrahi bir başlık, yüz maskesi, elbise ve eldiven giyilmelidir. Hayatta kalma ameliyatları için hayvanın ameliyat öncesi hazırlığı aşağıdaki protokole dahil edilmiştir. Reaktiflerin ve ekipmanların bir listesi için Tablo 1'e bakın.

1. Primer Memeli Tümörlerden Tek Hücreli Süspansiyonların İzolasyonu ve Hazırlanması

1. Denekli dişi 100 günlük transgenik MMTV-PyMT (FVB / n) farelerde anestezi uygulayın ve c altında tutunAnestezi maskesi vasıtasıyla% 2 izofluran uygulayarak onutuous sedasyon. Farenin, ayak bileği sıkışmayan bir refleksle düzgün şekilde anestezi edildiğinden emin olun.
2. Steril bir ortamda meme tümörünü steril makas kullanarak üstteki deri ve çevre doku dokusundan ve / veya lenf düğümlerinden ayırarak 100 günlük transgenik dişi MMTV-PyMT (FVB / n) farelerdeki primer meme tümörlerini rezekte edin. Anestezi uygulanmış fareleri servikal dislokasyonla euthanize edin.
3. Steril makas veya bir neşterle, primer tümörleri elle küçük parçalara (~ 1.0 mm ³ ) koyun. Tümör parçalarını 3.0 mg / mL kollajenaz A'ya ve 4.0 U / mL DNase I'e DMEM içerisinde çözündürün. 1.0 cm çaplı tümör için ~ 10 mL yukarıdaki sindirim ortamını kullanın.
   1. Steril 25 mL'lik bir şişede ~ 125 rpm'de ve 37 ° C'de 40 dakika süreyle steril bir karıştırma çubuğu ile sindirim yapın.
4. % 10'luk nihai bir seyreltiye fetüs sığır serumu (FBS) ekleyerek sindirimi durdurun ve tüm karışımı wEt buz burada muhafaza edilir.
5. Sindirilmiş tümör süspansiyonunu 0,7 μm'lik bir naylon süzgeçten 50 mL'lik bir konik tüpe süzün ve süzgeçte kalan tümörleri atın. Süpernatantı 300 xg'de 4 ° C'de santrifüjleyin.
6. 1.0 cm tümör başına pelet 10 mL DMEM'de süspansiyon haline getirin ve 0.7 μm'lik bir naylon süzgeç ile yeniden filtre edin. Hücre konsantrasyonunu sayın, daha sonra 4 ° C'de 300 xg'de santrifüjleyin.
7. 2 x 10 ⁷ canlı hücre / mL'lik bir konsantrasyonda% 90 FBS ile% 10 dimetil sülfoksit içinde süspanse edin pelet. Tüm primer tümörün tek hücre süspansiyonlarını -80 ° C'de saklayın.

2. Anne tümörünün ortotopik enjeksiyonu

1. Donmuş primer tümör süspansiyonlarını 37 ° C'de kısmen çözdürüp dondurulmuş pelet kriyojenik tüpten 20 mL DMEM'ye salınana ve hücreleri sayana kadar eritin. 4 ° C'de 300 xg'de santrifüjleyin ve hücreleri 1: 1 DMEM'de tekrar süspansiyon haline getirin: büyüme faktörü azaltılmış çözündürülmüş bazal membran hazırlığı eEngelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan 1 x 10 ⁷ hücre / mL konsantrasyonda çıkarıldı (Bkz . Malzeme Tablosu ).
2. Anestezi uygulanmış alıcı dişi syngeneic fare ventral tarafı yerleştirin ve bir anestezi maskesi ile% 2 izofluran uygulayarak sürekli sedasyon altında korumak.
3. Sağdaki 4. meme bezi enjeksiyon alanını aerosol haline getirilmiş% 70 etanol kullanarak sterilize edin ve steril bir pamuklu çubuk ile Poli (vinilpirolidon) -İyodan geçirin.
4. 29 G 0.3 mL insülin şırıngası kullanılarak, 6 ila 10 haftalık dişi FVB / N fare temizlenmemiş sağ 4 meme bezine 100 uL (dondurulmuş primer tümör süspansiyonlardan, 1 x 10 ⁶ canlı hücreler) konik yan enjekte edilir.

3. Ortotopik meme tümörünün cerrahi rezeksiyonu

1. Tümör hücresi enjekte edildikten sonra 38-60 gün sonra, farelere hacim olarak ³ mm'lik 450-172 arasında [x uzunluğunda uzanan ortotopik tümör hacimleri arzetmeyen ötenazi (genişliği ²
2. Bir anestezi maskesi ile% 2 izofluran uygulamak suretiyle sürekli sedasyon altında uygun tümör boyutu ventral tarafı gösteren anestezi uygulanmış fareler yerleştirin ve fare uygunsuz ayak tutam refleksiyle düzgün şekilde anestezi doğrulayın. Sedasyon sırasında kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi uygulayın.
3. Primer tümörü çevreleyen cerrahi alanı sterilize etmek için% 70 etanol püskürtün, daha sonra bir steril pamuklu çubuk ile Poli (vinilpirolidon) -İyoden uygulayın.
   NOT: Cerrahi bölgedeki epilasyon% 5 farelerde deri ekskoriasyonları ve / veya enfeksiyonlarla sonuçlanmıştır ve bu nedenle bu adımdan çıkarılmıştır (veriler gösterilmemiştir).
4. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, tümörün medial-kaudal künt makas kullanılarak ilk cilt insizyonu yapın.
5. Sonra, tümörün medialinde cildin üstün bir eksizyonu yapın ( Şekil 1C ). Herhangi bir vaskülatürü cauterize etme ihtiyacına dikkat edin.Insizyonu uzatmadan önce deride bulunan tümörü düzenleyebilir.
6. Deri kesisini lateral olarak (tümörün posterioru) devam edin, daha sonra üstün bir deri eksizyonu (tümöre lateral) ve medial eksizyonu (tümöre üstün) ( Şekil 1C ) yapın.
7. Cilt tümör çevresinde çevresel olarak eksize edildikten sonra ( Şekil 1C ), tümörü karın duvar kas sisteminden uzakta keserek ve meme bezlerini sağlam tutarak, forseps kullanarak tümörün üstündeki cildi kaldırın.
8. (Künt diseksiyon ile) belirlenmesi ve 4 ve ^5. meme bezlerinin içinden geçen büyük gemiler dağlamak.
9. Tüketim yaklaşık tümör serbest dağlama sitesinde 4 ve ^5. meme bezlerinin yarısı üzerinde bulunan deri ve meme bezleri (Şekil 1C) bölümleri.
10. Kanama durumunda, aktif kanamayı tanımlayınGemileri derhal saklayın ve hemen onlara koterleyin. 250 μL'den fazla kan kaybederse, fareyi çalışmadan çıkarın ve euthanize edin.
11. Yara klipleri ile yara klipi uygulayıcısı kullanarak eksizyon yerlerini kapatın ( Şekil 1C ).
    NOT: Ameliyattan 10 gün sonra yara klipslerini bir yara klipsi çıkarıcı ile çıkartın.
12. Deri altı (hayvanin vücut ağırlığının% 4'ü) sıcak steril salin uygulayın ve hayvanı bir ısı lambası ile sıcak tutun. Anesteziden kurtulma işlemi sırasında 5-10 dakikada bir hayvanları kontrol edin.
    NOT: Bupivakain veya lidokain uygulaması post-operatif mortaliteyi artırmıştır (veriler gösterilmemiştir). Ameliyattan 1 saat sonra ağrı belirtileri gösteren (ağrıyan, taşımak istemeyen, damat yapamayan) fareler ötenazi görmüştür.
    1. Fareler tamamen kurtarıldıktan sonra, diğer farelerin şirketlerine geri gönderin.

Akım Sitometri ve Histoloji için Kan Akciğerinin İzolasyonu ve İşlenmesi

1. Çalışma bitim noktalarında, istenirse fareleri çeşitli histopatolojik değerlendirmeler için hazırlayın. Ötenaziden 90 dakika önce, her fareye, 1x PBS'de 6.25 μg / μL'lik bir konsantrasyonda bromodeoksiüridin (BrdU, 50 μg / g fare ağırlığı) intraperitoneal bir enjeksiyonu yapın.
   NOT: Dondurulmuş çözünmüş bromodeoksiuridin stokları, hazırlandıktan sonraki 1 ay içerisinde kullanılır.
2. Anestezi uygulanan fare ile ötenazi uygulamasının başlamasından 10 dakika önce, heparinize kılcal tüpler kullanarak retroorbital kan (> 500 μL) toplayın ve ardından buz üzerinde tutulan dipotasyum EDTA ile kaplanmış tüplere aktarın.
3. Göğüs ve periton boşlukları (Şekil 2A) ortaya çıkarmak için ağza alt karın makas ile orta hat kesi yapmak, akciğerler ve geri kalan meme dokusu kaldırmak ve deri soyma için yanal olarak da meme ^inci kalan sağ ^4. ve 5. ortaya çıkarmak için bezleri.
4. Geriye kalan meme bezi dokusunu tüketim yapın ve i(FFPE) dokusunu, hematoksilen ve eozin (H & E) boyama ile değerlendirerek birincil tümör büyümesini göz önüne almamaktadır ( Ek Şekil 1 ).
5. Akciğerleri çıkarmak için abdominal duvarı makasla diyaframa açın, akciğerlerin perfüzyonundan önce kan boşaltmak için karın aortunu keserek hayvanını euthanize edin ( Şekil 2B -2C ).
6. Diyaframı, akciğer ve kalpten kaçınmayı sağlayan abdominal bir yaklaşımla kaburga kafesi boyunca kesin. Daha sonra, göğüs kafesini, göğüs kafesinin yan kenarlarını keserek maruz bırakın ( Şekil 2D ).
7. 20 mL şırınga üzerinde 23 gauge iğne kullanarak akciğerler tamamen beyaza dönüşene kadar kalp sağ ventrikülünden ~ 5.0 mL DPBS (~ 10 mL / dakika) ile akciğerleri boşaltın ( Şekil 2E -2F ). Ana gemiden kalbi derhal kesYani kan akciğerine yeniden nüfuz etmez.
8. Akciğer dokusunun histopatolojik değerlendirmeler için işlenmesi için, 23 gauge iğne ( Şekil 2G - 2H ) kullanarak maruz kalmış trakea şişkin tarafı yukarı doğru akciğerlere doğru ~ 1.0 mL% 10 formalin 4 ° C'de enjekte edin. Akciğerler tamamen genişletilir ve fiksatif ile dolduğunda enjeksiyon kesilir ( Şekil 2I ).
9. Trakeadan akciğer loblarını ayırın ve standart histopatolojik prosedürlere göre akupunktur akciğer dokusunu nötral tamponlu formalinde, sonraki parafin yerleştirme veya OCT-dondurucu ortam için düzeltin.
10. Akciğerlerdeki metastatik yükü FFPE akciğer dokusunun kesit bölümlemesi ile nicel olarak değerlendırın ve mikrotom kesitlerini (100 μm, on üç bölüm) H & E boyama ile değerlendirin ( Şekil 1B ).

Sonuçlar

Daha MMTV PyMT farelerden türetilen primer meme tümörlerinden, 1 x 10 ⁶ hücre alan alıcı farelerin% 75, daha 172 ila 450 ^mm3 38-60 içinde gün arasında değişen tek bir meme adenokarsinomu geliştirmek (veriler gösterilmemiştir). Daha sonra randomize edilmeye uygun olan fareler, gösterildiği gibi primer tümörlerin cerrahi rezeksiyonunu takiben çalışma gruplarına alınır ( Şekil 1C ). Primer tümör yeniden büyümes...

Tartışmalar

Değişiklikler ve sorun giderme:

Tümör karın duvarından uzak künt diseksiyon yaparken, tümör karın duvarına yapışmış kalabilir. Bu, tümör enjekte edilen farelerin <% 5'inde gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir). Karın duvarına yapışık tümörleri olan fareler için, fare, birincil tümör yeniden büyümesi olmaksızın rezeksiyon zor olduğu için ötenazi yapılmalıdır.

Model / teknik sınırlamaları...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800