前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

要約

乳癌の転移を標的としたアジュバント療法を評価する前臨床モデルは欠けている。これに対処するために、本発明者らは、アジュバント設定（原発腫瘍の外科的切除後）で投与された治療が、以前に播種された肺転移に影響を及ぼす有効性について評価され得る、 新規な肺乳腺腺癌転移のマウスモデルを開発した。

要約

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

概要

北アメリカの女性は、乳がん²を発症する生涯リスクが〜12％です。これらの個体の大多数は、手術により摘出された原発腫瘍を有し、がんサブタイプに応じて、アジュバント設定^3で標的、内分泌、化学療法および/または放射線療法を受ける。何の標的療法は、トリプルネガティブ腫瘍の³のためにまだ利用できないのに対し、例としては、放射線/化学療法とHER2標的治療を受けたHER2陽性腫瘍を抗エストロゲン療法と女性を受けるホルモン受容体陽性癌と診断された女性が含まれます。外科的切除を補完する放射線、化学療法、パーソナライズされたホルモン療法の進歩にもかかわらず、病気はステージIIまたはIIIの病気と診断された女性の30〜70％で再発する⁴ 、遠隔臓器における転移性疾患の根絶には効果がほとんどない肺、骨、b雨および/または肝臓⁵ 。これは、転移性疾患が原発腫瘍再増殖の不在下で起こる場合、これは、播種性悪性細胞が確定手術の時点で二次臓器にすでに存在している可能性があることを意味するので、特に重要である。したがって、転移性腫瘍の根絶または緩徐化が可能な治療法が急務である。

乳腺発がんの新規のマウスモデルは、腫瘍性の進行^1を制御するメカニズムを明らかに著しく有益であったが、既存のモデルにもいくつかの制限があります。これらのうちの1つは、 新規のトランスジェニックモデルが典型的には、原発腫瘍負荷が研究の期間を制限する複数の乳腺において原発腫瘍を発症するという事実である。原発腫瘍細胞の逃避および転移播種は、これらのモデルにおける新生物の進行の早期に起こる可能性が高いが、転移性腫瘍の率直な発達は遅く起こり、マウスモデルと株のバックグラウンドは、しばしば部分的に浸透している¹ 。これは、二次器官における転移を制御する分子の発見のための新規モデルの有用性をさらに制限し、アジュバント設定における治療薬の臨床前の有効性を評価するためにさらに制限する。

これらの制限を回避するために、我々は、肺への乳癌の転移の新たな土着モデルを開発しました。後期デノボ乳腺腫瘍を担持（FVB / N本明細書に記載の研究のための株バックグラウンドで、すなわち 、MMTV-PyMT）親トランスジェニック雌は〜100日⁶歳であり、それらの原発腫瘍をその時点で外科的に切除し、酵素的に解離されています単一細胞懸濁液。単一の原発性乳腺腫瘍が38〜60日の期間に亘って発生する6〜7週齢のレシピエント同系雌性マウスに懸濁液（1×10 ⁶細胞）を順化させる図1A）。定義された腫瘍サイズ（172〜450mm ³ ）で、レシピエントマウスを麻酔し、原発腫瘍を外科的切除して、外科手術部位での腫瘍再増殖を最小限に抑え、女性の手術と一致させる（ 補足図1 ）。 FVB / n株のバックグラウンドでは、マウスは手術後約115日までに45％の浸透率を有する肺で組織学的に検出可能な転移病巣を発症する（ 図1B ）。転移腫瘍増殖の延長された潜伏期間により、このモデルは、補助的治療の送達、および原発腫瘍の外科的除去後の転移性進行に影響を及ぼす基礎となる生物学の解明および評価のために独特に位置付けられる。

プロトコル

以下のプロトコルで使用される動物は、動物福祉法規制および公衆衛生サービス（PHS）ポリシーに準拠するように設計された、オレゴン保健科学大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）の対象となります。

滅菌条件の維持：滅菌済みの器具を使用し、マウス間で滅菌ガーゼで拭き取り、PBSですすぎ、次に消毒剤70％エタノールで少なくとも15分間滅菌する必要があります。生存手術のためには、外科用キャップ、フェイスマスク、ガウン、手袋を着用する必要があります。生存手術のための動物の手術前の準備は、以下のプロトコールに含まれる。試薬および機器のリストについては、表1を参照してください。

原発性乳腺腫瘍からの単細胞浮遊液の分離および調製

1. ドナーの雌100日齢のトランスジェニックMMTV-PyMT（FVB / n）マウスに麻酔をかけ、c2％イソフルランを麻酔マスクを介して投与することにより、連続的な鎮静を行う。フットピンチ反射がない状態でマウスが正しく麻酔されていることを確認します。
2. 滅菌設定では、100日齢のトランスジェニック雌性MMTV-PyMT（FVB / n）マウス由来の原発性乳腺腫瘍を、無菌ハサミを用いて上皮および周囲の脂肪組織および/またはリンパ節から乳房腫瘍を分離することによって切除する。頸部脱臼により麻酔したマウスを安楽死させる。
3. 滅菌はさみまたはメスを使用して、原発腫瘍を手動で小片（約1.0mm ³ ）に切ります。腫瘍片を3.0mg / mLのコラゲナーゼAおよび4.0U / mLのDNアーゼIをDMEMに溶解したものに入れる。直径1.0cmの腫瘍あたり約10mLの上記消化培地を使用する。
   1. 〜125rpm、37℃で40分間無菌攪拌棒を用いて滅菌25mLボトルで消化を行います。
4. ウシ胎児血清（FBS）を最終希釈10％に加えて消化を停止し、混合物全体をwそれは維持されています。
5. 消化した腫瘍懸濁液を0.7μmのナイロンストレーナーで50mLコニカルチューブに濾過し、ストレーナーに残っている腫瘍を捨てる。 4℃で300 xgで上清を遠心分離する。
6. ペレットを1.0cmの腫瘍あたり10mLのDMEMに再懸濁し、0.7μmのナイロンストレーナーで再濾過する。細胞濃度を数え、4℃で300 xgで遠心分離します。
7. ペレットを2×10 ⁷個/ mLの濃度で90％FBSを含む10％ジメチルスルホキシドに再懸濁する。 -80℃で全原発腫瘍の単細胞懸濁液を保存する。

2.乳腺腫瘍の同所性注射

1. 凍結したペレットを極低温チューブから20mLのDMEMに放出し、細胞を計数するまで37℃で凍結した原発腫瘍懸濁液を部分的に解凍する。 4℃で300 xgで遠心分離し、1：1 DMEM：増殖因子で還元された基底膜調製物eで細胞を再懸濁する。Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫から1×10 ⁷細胞/ mLの濃度で採取した（ 表の表を参照）。
2. 麻酔をかけたレシピエントの同系マウスの腹側を上に置き、麻酔マスクを介して2％イソフルランを投与することにより、連続鎮静下に維持する。
3. エアロゾル化した70％エタノールを使用して右第4乳腺注射部位を滅菌し、ポリ（ビニルピロリドン） - ヨウ素を滅菌綿棒で塗布する。
4. 29 G 0.3 mLインスリン注射器を使用して、6〜10週齢の女性のFVB / nマウスの右胸部第4乳腺に100μL（凍結原発腫瘍懸濁液から1×10 ^6個の生存細胞）を斜面側に注入する。

3.同所性乳腺腫瘍の外科的切除

1. 腫瘍細胞注入の38〜60日後、172〜450mm ^3の範囲の同所性腫瘍体積を示さないマウスを安楽死させる[長さx（幅²
2. 麻酔マスクを介して2％イソフルランを投与することにより、連続鎮静下で適切な腫瘍サイズの腹側を上にして麻酔したマウスを配置し、マウスが不足足ピンチ反射で適切に麻酔されていることを確認する。鎮静下での乾燥を防ぐために、眼に獣医軟膏を塗布する。
3. 原発腫瘍を取り囲む手術領域を滅菌するために70％エタノールをスプレーし、ポリ（ビニルピロリドン） - ヨウ素を滅菌綿棒で塗布する。
   注：外科部位での脱毛は〜5％のマウスの皮膚擦過傷および/または感染をもたらし、したがってこの工程から除外した（データは示していない）。
4. 図1Cに示すように、腫瘍の内側尾の鈍いはさみを使用して、最初の皮膚切開を行う。
5. 次に、腫瘍の内側の皮膚（ 図1C ）の優れた切除を行う。任意の血管系を焼灼する必要性に注意を払う切開部を拡張する前に皮膚上に位置する腫瘍を切除する。
6. 横方向（腫瘍の後方）で皮膚切開を継続し、優れた皮膚切除（腫瘍に対して側方）および内側切除（腫瘍に対して優位）を行う（ 図1C ）。
7. 皮膚を腫瘍の周りに円周方向に切除した後（ 図1C ）、腫瘍に付着した皮膚を鉗子で持ち上げ、腹壁筋肉から腫瘍を摘出し、乳腺をそのままにする。
8. ^第 4および^第 5乳腺を通っている大きな血管を（鈍的な切開によって）同定し、焼灼する。
9. 焼灼部位で4 ^番目と5 ^番目の乳腺のおよそ半分を切除して、腫瘍、上皮、および乳腺のセグメントを解放する（ 図1C ）。
10. 出血の場合は、積極的に出血を確認するすぐにそれらを焼灼する。 250μL以上の血液が失われた場合は、マウスを研究から除外し安楽死させる。
11. 創傷クリップアプライヤを用いて創傷クリップを用いて切除部位を閉じる（ 図1C ）。
    注：創傷クリップ除去剤で外科手術の10日後に創傷クリップを除去する。
12. 暖かい滅菌生理食塩水を皮下に投与し（動物の体重の4％）、加熱ランプで暖かい動物を保つ。麻酔からの回復の間、動物を5〜10分ごとに点検する。
    注：ブピバカインまたはリドカインの投与は術後死亡率を増加させた（データは示さず）。手術後1時間で、痛みの徴候を示すマウス（鈍感、動かない、身づくろい）を安楽死させた。
    1. マウスが完全に回復したら、それを他のマウスの会社に戻します。

フローサイトメトリーおよび組織学のための血液および肺の単離および処理

1. 研究のエンドポイントでは、必要に応じて様々な組織病理学的評価のためにマウスを準備する。安楽死の90分前に、各マウスに1x PBS中6.25μg/μLの濃度のブロモデオキシウリジン（BrdU、50μg/ gマウス重量）の腹腔内注射を行う。
   注：溶解したブロモデオキシウリジンの凍結ストックは、調製後1ヶ月以内に使用する。
2. マウスを麻酔した後、安楽死の10分前に、ヘパリン処理された毛管を用いて眼窩後血液（>500μL）を収集し、続いて氷上に保持されたEDTA二カリウムで被覆したチューブに移す。
3. 肺および残りの乳房組織を除去するために、胸郭および腹腔（ 図2A）を露出させ、また、乳房^番目の残りの右4 ^番目と5を露出させるために横方向に皮膚を剥離するために口に下腹部からハサミで正中切開を行います腺。
4. 残りの乳腺組織を切除し、iを検査する。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色（ 補助的な 図1 ）による連続切片ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織を評価することにより、原発腫瘍再増殖を除外する。
5. 肺を除去するには、はさみで隔壁に隔壁を開き、肺の灌流の前に血液を排出するために腹部大動脈を切断して動物を安楽死させる（ 図2B -2C ）。
6. 肺と心臓を避けるように腹部アプローチから胸郭に沿って横隔膜を切る。次に、胸郭の側面を切断して胸郭を露出させます （ 図2D ）。
7. 20mLシリンジで23ゲージの針を使用し、肺が完全に白くなるまで心臓の右心室を通して約5​​.0mLのDPBS（約10mL /分）で肺を灌流する（ 図2E -2F ）。メインの船からすぐに心臓を切り離す血液は肺に再灌流しません。
8. 肺組織を固定し、組織病理学的評価のために処理されるために、23ゲージ針（ - 2H 図2G）を使用して肺に向かって露出した気管ベベル側に4℃〜1.0mLの10％ホルマリンを注入します。肺が完全に拡張され、固定剤で満たされると注射を止める（ 図2I ）。
9. 標準的な組織病理学的手順に従って、その後のパラフィン包埋またはOCT凍結培地のために、中空緩衝ホルマリン中の肺組織を気管から排出し、エマルジョンで固定する。
10. FFPE肺組織の連続切片化により肺における転移性負荷を定量的に評価し、H＆E染色（ 図1B ）によってミクロトーム切片（100μm、13切片）を評価する。

結果

MMTV-PyMTマウス由来の原発性乳腺腫瘍由来の1×10 ⁶細胞を受けるレシピエントマウスの75％超が、38〜60 ^日以内にサイズが172〜450mm ^3の単一の乳腺腺癌を発症する（データ示さず）。無作為化の可能性のあるマウスを、次に示されるように原発腫瘍の外科的切除後に研究グループに登録する（ 図1C ）。原発腫瘍の外科的切除?...

ディスカッション

変更とトラブルシューティング：

鈍的な腫瘍を腹壁から摘出するとき、腫瘍は腹壁に付着したままである可​​能性がある。これは腫瘍を注射したマウスの5％未満で観察された（データは示さず）。腹壁に付着した腫瘍を有するマウスの場合、原発腫瘍の再増殖なしには切除が困難であるため、マウスを安楽死させるべきである。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800