Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de<em&gt; De Novo</em&gt; Metástase do câncer mamário

Resumo

Não faltam modelos pré-clínicos que avaliam a terapia adjuvante visando metástases de câncer de mama. Para abordar isso, desenvolvemos um modelo murino de metástase de adenocarcinoma mamário pulmonar de novo , em que as terapias administradas na configuração adjuvante (ressecção pós-cirúrgica de tumores primários) podem ser avaliadas quanto à eficácia no impacto de metástases pulmonares previamente semeadas.

Resumo

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introdução

As mulheres na América do Norte têm um risco de vida de até 12% de desenvolver câncer de mama ² ; A maioria destes indivíduos terá tumores primários removidos por cirurgia e, dependendo do subtipo de câncer, receberá terapia direcionada, endócrina, quimioterapia e / ou radioterapia na configuração adjuvante ³ . Exemplos incluem, mulheres diagnosticadas com câncer de receptores hormonais positivos que recebem terapias anti-estrogênio e mulheres com tumores HER2-positivos que recebem terapias direcionadas a HER2 com radiação / quimioterapia, enquanto que não há terapias direcionadas ainda disponíveis para tumores triplos negativos ³ . Apesar dos avanços em terapias de radiação, quimioterapia, terapias hormonais personalizadas que complementam a ressecção cirúrgica, a doença se repete em 30-70% das mulheres diagnosticadas com doença do estágio II ou III ⁴ , pois as terapias são em grande parte ineficazes na erradicação da doença metastática em órgãos distantes, inclusive Pulmão, osso, bChuva e / ou fígado ⁵ . Isto é especialmente significativo dado que, quando a doença metastática ocorre na ausência de rebrota primária do tumor, isso implica que as células malignas disseminadas provavelmente já estão presentes nos órgãos secundários no momento da cirurgia definitiva. Assim, as terapias capazes de erradicar ou retardar o crescimento de tumores metastáticos são urgentemente necessárias.

Enquanto de novo modelos de ratinho de cancro mamário têm sido notavelmente informativo em revelar os mecanismos que regulam a progressão neoplásica ^1, os modelos existentes também têm várias limitações. Um deles é o fato de que os modelos transgênicos de novo tipicamente desenvolvem tumores primários em múltiplas glândulas mamárias, em que a carga tumoral primária limita a duração dos estudos. Enquanto a fuga de células tumorais primárias e a amadurecimento metastático provavelmente ocorrem precocemente na progressão neoplásica nestes modelos, o desenvolvimento franco de tumores metastáticos ocorre tarde e dependendo deNo modelo do mouse e no fundo da tensão, muitas vezes é parcialmente penetrante ¹ . Isto limita ainda mais a utilidade de modelos de novo para a descoberta de moléculas que regulam a metástase em órgãos secundários e para avaliar a eficácia pré-clínica da terapêutica no ambiente adjuvante.

Para contornar essas limitações, desenvolvemos um modelo autônomo de novo de metástase de carcinoma mamário em pulmões. As fêmeas transgênicas parentais ( isto é , MMTV-PyMT no fundo da cepa FVB / n para os estudos aqui descritos) que levam tumores mamários de novo em estágio de novo são envelhecidos para ~ 100 dias ⁶ , altura em que seus tumores primários são ressecados cirurgicamente e se dissociaram enzimaticamente Suspensões de célula única. As suspensões (1 x 10 ⁶ células) são, por sua vez, explotadas ortotópicamente em camundongos singênicos receptores de 6-7 semanas de idade, onde os tumores mamários primários isolados se desenvolvem ao longo de um período de 38 a 60 dias ( Figura 1A). Num tamanho do tumor definida (172-450 ^mm3), os ratinhos receptores são anestesiados e tumores primários são cirurgicamente ressecado de tal modo que o crescimento do tumor no local da cirurgia é minimizado, consistente com a cirurgia em mulheres (Recurso Figura 1). No fundo da tensão FVB / n, os camundongos desenvolvem focos metastáticos histologicamente detectáveis ​​em pulmões com 45% de penetrância por ~ 115 dias após a cirurgia ( Figura 1B ). Com esta latência prolongada de crescimento de tumores metastáticos, o modelo está em posição única para a administração de terapia adjuvante e para elucidar e avaliar a biologia subjacente que influencia a progressão metastática após a remoção cirúrgica de tumores primários.

Protocolo

Os animais utilizados no seguinte protocolo são cobertos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Saúde e Ciência da Oregon (IACUC), que é projetado para ser compatível com os regulamentos da Lei de Bem-Estar Animal e com a Política do Serviço de Saúde Pública (PHS).

Manutenção de condições estéreis: instrumentos esterilizados devem ser utilizados e entre ratos, devem ser limpos com gaze estéril, enxaguados em PBS, seguido de esterilização com desinfectante a 70% de etanol durante pelo menos 15 minutos. Uma gola cirúrgica, uma faca, vestido e luvas devem ser usadas para cirurgias de sobrevivência. A preparação pré-operatória do animal para cirurgias de sobrevivência está incluída no seguinte protocolo. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de reagentes e equipamentos.

1. Isolamento e preparação de suspensões monocelulares de tumores mamários primários

1. Anestesiar os ratinhos transgênicos MMTV-PyMT (FVB / n) transgênicos de 100 dias do sexo doador e manter sob cSedação ontinuosa administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia. Confirme se o mouse está devidamente anestesiado com um reflexo de pitada do pé ausente.
2. Em um ambiente estéril, resectam tumores mamários primários de ratos MMTV-PyMT femininos transgênicos (FVB / n) de 100 dias, separando o tumor mamário da pele subjacente e tecido adiposo adjacente e / ou linfonodos usando tesoura estéril. Eutanizar os camundongos anestesiados por luxação cervical.
3. Com tesoura estéril ou um bisturi, mole os tumores primários manualmente em pequenos pedaços (~ 1,0 mm ³ ). Coloque peças tumorais em 3,0 mg / mL de colagenase A e 4,0 U / mL de DNase I dissolvidas em DMEM. Use ~ 10 mL do meio de digestão acima por tumor de 1,0 cm de diâmetro.
   1. Execute a digestão em um frasco estéril de 25 mL com uma barra de agitação estéril a ~ 125 rpm e 37 ° C durante 40 min.
4. Pare a digestão adicionando soro bovino fetal (FBS) a uma diluição final de 10% e coloque toda a mistura em wE o gelo onde é mantido.
5. Filtre a suspensão do tumor digerido através de um filtro de nylon de 0,7 μm em um tubo cônico de 50 mL e descarte qualquer tumor restante no filtro. Centrifugar o sobrenadante a 300 xg a 4 ° C.
6. Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM por tumor de 1,0 cm e re-filtrar através de um filtro de nylon de 0,7 μm. Contagem de concentração de células, depois centrifugue a 300 xg a 4 ° C.
7. Resuspender o sedimento em 10% de sulfóxido de dimetilo com 90% de FBS a uma concentração de 2 x 10 ⁷ células vivas / mL. Armazene suspensões monocelulares de tumor primário inteiro a -80 ° C.

2. Injeção orotópica de tumor mamário

1. Parcialmente descongelar suspensões tumorais primárias congeladas a 37 ° C até que o sedimento congelado possa ser liberado do tubo criogênico em 20 mL de DMEM e contar as células. Centrifugação a 300 xg a 4 ° C e ressuspender as células em um DMEM 1: 1: fator de crescimento - preparação de membrana basal solubilizada reduzida eExtraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) em uma concentração de 1 x 10 ⁷ células / mL (ver Tabela de Materiais ).
2. Coloque o lado ventral do lado singênico feminino do receptor anestesiado para cima e mantenha-se sob sedação contínua administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia.
3. Esterilizar o 4º local de injeção da glândula mamária direita utilizando etanol 70% em aerossol e aplicar Poly (vinilpirrolidona) - Iodina com um cotonete de algodão estéril.
4. Injetar 100 μL (1 x 10 ⁶ células vivas a partir de suspensões tumorais primárias congeladas) lado biselado para cima na glândula mamária direita não esclerada do fVB / n feminino de 6 a 10 semanas usando uma seringa de insulina de 29 g 0,3 mL.

3. Ressecção cirúrgica do tumor ortopopear mamário

1. 38-60 dias após a injeção de células tumorais, eutanizar camundongos que não exibam volumes de tumor ortotópico variando entre 172 a 450 mm ³ em volume [comprimento x (largura ² ) / 2] (cerca de 75% dos ratinhos injetados).
2. Coloque ratos anestesiados que exibam o lado ventral adequado do lado ventral sob sedação contínua, administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia e confirme que o mouse está devidamente anestesiado com um reflexo de pitada do pé ausente. Aplique pomada veterinária aos olhos para prevenir a secura enquanto estiver sob sedação.
3. Pulverize 70% de etanol para esterilizar a área cirúrgica que envolve o tumor primário e, em seguida, aplique Poli (vinilpirrolidona) - Iodina com um cotonete de algodão estéril.
   NOTA: A remoção do cabelo no local cirúrgico resultou em escoriações e / ou infecções da pele para ~ 5% de camundongos e, portanto, foi excluída desta etapa (dados não mostrados).
4. Conforme mostrado na Figura 1C , faça uma incisão inicial da pele usando tesouras bruscas medial-caudal ao tumor.
5. Em seguida, faça uma excisão superior da pele ( Figura 1C ) medial ao tumor. Preste atenção à necessidade de cauterizar qualquer vasculatura fePuxando o tumor localizado na pele antes de estender a incisão.
6. Continue a incisão da pele lateralmente (posterior ao tumor), em seguida, faça uma excisão da pele superior (lateral ao tumor) e a excisão medial (superior ao tumor) ( Figura 1C ).
7. Depois que a pele foi excisada circunferencialmente em torno do tumor ( Figura 1C ), levante a pele sobreposta ao tumor usando fórceps enquanto dissimulam o tumor distante da musculatura da parede abdominal e mantendo as glândulas mamárias intactas.
8. Identificar (por dissecção romba) e cauterizar os vasos grandes que funcionam através das glândulas mamarias 4 e 5 ^{th th.}
9. Especial de consumo de aproximadamente metade dos 4 e 5 ^{th th} glândulas mamárias no local de cauterização para libertar o tumor, sobrepondo-se a pele, e os segmentos das glândulas mamarias (Figura 1C).
10. Em caso de sangramento, identifique hemorragia ativamenteVasos e imediatamente cauterizá-los. Se perder mais de 250 μL de sangue, exclua o mouse do estudo e faça uma eutanásia.
11. Feche os locais de excisão com clipes de ferida usando um aplicador de clip de ferida ( Figura 1C ).
    NOTA: Remova os grampos da ferida 10 dias após a cirurgia com um removedor de grampo da ferida.
12. Administrar solução salina estéril quente por via subcutânea (4% do peso corporal do animal) e manter o animal quente com uma lâmpada de calor. Verifique os animais a cada 5-10 min durante a recuperação da anestesia.
    NOTA: A administração de bupivacaína ou lidocaína aumentou a mortalidade pós-operatória (dados não apresentados). Ratos que apresentavam sinais de dor (hunching, não desejoso de se mover, falta de noivo) 1 h após a cirurgia foram eutanasiados.
    1. Uma vez que o mouse se tenha recuperado completamente, devolva-o à empresa de outros ratos.

4. Isolamento e processamento de sangue e pulmão para citometria e histologia de fluxo

1. Nos pontos finais do estudo, prepare ratos para várias avaliações histopatológicas, se desejar. 90 min antes da eutanásia, dê a cada rato uma injeção intraperitoneal de bromodesoxiuridina (BrdU, 50 μg / g de peso do mouse) a uma concentração de 6,25 μg / μL em 1x PBS.
   NOTA: Os estoques congelados de bromodesoxiuridina dissolvida são utilizados no prazo de 1 mês após a preparação.
2. 10 min antes da eutanásia, com o rato anestesiado, coletar sangue retroorbitário (> 500 μL) usando tubos capilares heparinizados e posteriormente transferir para tubos revestidos com EDTA dipotássico em gelo.
3. Para remover dos pulmões e do tecido mamário remanescente, fazer uma incisão na linha média com as tesouras do abdómen inferior ao da boca para expor o torácica e cavidades peritoneais (Figura 2A), e tirar a pele lateralmente para também expor o restante 4 ^th direita e 5 ^th mamária Glândulas.
4. Impeça o tecido remanescente da glândula mamária e examine iT para excluir o rebrote primário do tumor, avaliando o tecido fixo em parafina (FFPE) seccionado em série, por coloração com hematoxilina e eosina (H & E) ( Figura 1 suplementar ).
5. Para remover os pulmões, abra a parede abdominal no diafragma com uma tesoura, eutanize o animal cortando a aorta abdominal para drenar o sangue antes da perfusão de pulmão ( Figura 2B- 2C ).
6. Corte o diafragma ao longo da caixa torácica de uma abordagem abdominal certificando-se de evitar o pulmão eo coração. Em seguida, exponha o tórax cortando os lados laterais da caixa torácica ( Figura 2D ).
7. Usando uma agulha de calibre 23 em uma seringa de 20 mL, perfume pulmões com ~ 5,0 mL de DPBS (~ 10 mL / min) através do ventrículo direito do coração até que os pulmões fiquem inteiramente brancos ( Figura 2E -2F ). Imediatamente corte o coração do vence principalÉ assim que o sangue não re-perfume no pulmão.
8. Para que o tecido pulmonar seja corrigido e processado para avaliações histopatológicas, injete 1,0 ml de formalina a 10% a 4 ° C no lado do bisel da traquéia exposto para cima em direção aos pulmões usando uma agulha de calibre 23 ( Figura 2G - 2H ). Injete a injeção quando os pulmões estiverem completamente expandidos e preenchidos com fixador ( Figura 2I ).
9. Os lóbulos de pulmão de consumo de escaras da traquéia e a emersão corrigem o tecido pulmonar em formalina de tampão neutro para subsequente inserção de parafina ou meio de congelação OCT, por procedimentos histopatológicos padrão.
10. Avalie quantitativamente a carga metastática nos pulmões por seção serial do tecido pulmonar do FFPE e avalie as seções dos micrótomos (100 μm, treze seções), por coloração H & E ( Figura 1B ).

Resultados

Mais do que 75% de ratinhos receptores que receberam 1 x 10 ⁶ culas de tumores mamários primários derivados de ratinhos MMTV-PyMT, desenvolver adenocarcinomas mamários individuais que variam em tamanho de 172-450 ^mm3 dentro de 38-60 dias (dados não mostrados). Os ratos elegíveis para randomização são então matriculados em grupos de estudo após ressecção cirúrgica de tumores primários, como mostrado ( Figura 1C ). O crescim...

Discussão

Modificações e solução de problemas:

Quando o tumor dissecante contundente longe da parede abdominal, o tumor pode permanecer aderente à parede abdominal. Isto foi observado em <5% de ratinhos injetados com tumor (dados não apresentados). Para camundongos com tumores aderentes à parede abdominal, o mouse deve ser eutanásico, pois a ressecção é difícil sem recriação tumoral primária.

Limitações do modelo / técnica:

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800