Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von<em&gt; De Novo</em&gt; Mamma Krebs Metastase

Zusammenfassung

Präklinische Modelle, die eine adjuvante Therapie mit Brustkrebs-Metastase auswerten, fehlen. Um dies zu lösen, entwickelten wir ein murines Modell der de novo pulmonalen Mamma-Adenokarzinom-Metastase, wobei Therapien, die in der adjuvanten Einstellung (postchirurgische Resektion von Primärtumoren) verabreicht werden, auf die Wirksamkeit bei der Auswirkung von zuvor gesäten pulmonalen Metastasen untersucht werden können.

Zusammenfassung

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Einleitung

Frauen in Nordamerika haben ein ~ 12% lebenslanges Risiko der Entwicklung von Brustkrebs ² ; Eine Mehrheit dieser Personen wird primäre Tumore über die Operation entfernt haben, und je nach Krebs Subtyp, wird dann erhalten gezielte, endokrine, Chemo- und / oder Strahlentherapie in der adjuvanten Einstellung ³ . Beispiele umfassen, mit Hormonrezeptor-positiven Tumoren diagnostizierten Frauen HER2-zielgerichteten Therapien mit Bestrahlung / Chemotherapie, während keine zielgerichteten Therapien noch verfügbar sind für triple negative Tumoren ³ Empfangen anti-Östrogen - Therapien und Frauen mit HER2-positiven Tumoren erhalten. Trotz Fortschritten in der Strahlung, Chemotherapie, personalisierte und Hormon-basierte Therapien, die chirurgische Resektion ergänzen, wiederholt sich die Krankheit bei 30-70% der Frauen, die mit der Stufe II oder III-Krankheit ⁴ diagnostiziert wurden, da Therapien bei der Beseitigung der metastatischen Erkrankung in entfernten Organen weitgehend unwirksam sind Lunge, Knochen, bRegen und / oder Leber ⁵ . Dies ist besonders bedeutsam, da bei der Metastasierung in Abwesenheit eines primären Tumorwachstums dies impliziert, dass disseminierte maligne Zellen wahrscheinlich bereits in sekundären Organen zum Zeitpunkt der endgültigen Operation vorhanden waren. So sind dringend Therapien erforderlich, um das Wachstum von metastatischen Tumoren zu beseitigen oder zu verlangsamen.

Während de novo Mausmodelle der Brustkarzinogenese bemerkenswert informativ bei der Aufdeckung von Mechanismen zur Regulierung der neoplastischen Progression ^{1 sind} , haben bestehende Modelle auch mehrere Einschränkungen. Eines davon ist die Tatsache, dass de novo transgene Modelle typischerweise Primärtumore in multiplen Brustdrüsen entwickeln, wobei die primäre Tumorbelastung die Dauer der Studien begrenzt. Während primäre Tumorzell-Flucht und metastatische Seeding wahrscheinlich früh in der neoplastischen Progression in diesen Modellen auftreten, entsteht eine offene Entwicklung von metastatischen Tumoren spät, und je nach oN der Maus Modell und Belastung Hintergrund, ist oft teilweise durchdringend ¹ . Dies begrenzt den Nutzen der de novo- Modelle zur Entdeckung von Molekülen, die die Metastasierung in sekundären Organen regulieren, und zur Bewertung der präklinischen Wirksamkeit von Therapeutika in der adjuvanten Umgebung.

Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelten wir ein de novo autochthones Modell der Mamma-Karzinom-Metastase in die Lunge. Parentale transgene Weibchen ( dh MMTV-PyMT auf dem FVB / n-Stammhintergrund für hierin beschriebene Studien), die Spätstadium de novo Mamma-Tumoren tragen, sind bis zu 100 Tage ⁶ gealtert, wobei zu diesem Zeitpunkt ihre primären Tumoren chirurgisch reseziert und enzymatisch dissoziiert werden Einzelzelle Suspensionen. Suspensionen (1 x 10 ⁶ Zellen) werden wiederum orthotopisch in 6-7-wöchige Empfänger-syngene weibliche Mäuse explantiert, wo sich einzelne primäre Mamma-Tumoren über einen Zeitraum von 38 bis 60 Tagen entwickeln ( Abbildung 1A). Bei einer definierten Tumorgröße (172 bis 450 mm ³ ) werden Empfängermäuse anästhesiert und Primärtumoren werden chirurgisch reseziert, so dass das Tumorwachstum an der chirurgischen Stelle minimiert wird, im Einklang mit der Operation bei Frauen ( Ergänzende Abbildung 1 ). Auf dem FVB / n-Stamm-Hintergrund entwickeln Mäuse histologisch nachweisbare metastatische Herde in der Lunge mit 45% Penetrance um ~ 115 Tage nach der Operation ( Abbildung 1B ). Mit dieser verlängerten Latenz des metastatischen Tumorwachstums ist das Modell eindeutig für die adjuvante Therapieabgabe positioniert und zur Aufklärung und Bewertung der zugrunde liegenden Biologie, die die metastatische Progression nach chirurgischer Entfernung von Primärtumoren beeinflusst.

Protokoll

Tiere, die in dem folgenden Protokoll verwendet werden, werden vom Oregon Health & Science University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) abgedeckt, das so konzipiert ist, dass es mit dem Tierschutzgesetz und dem Public Health Service (PHS) -Politik übereinstimmt.

Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen: Sterilisierte Instrumente sollten verwendet werden und zwischen Mäusen, sollte mit steriler Gaze abgewischt werden, in PBS gespült, gefolgt von Sterilisation mit Desinfektionsmittel 70% Ethanol für mindestens 15 Minuten. Eine chirurgische Kappe, Gesichtsmaske, Kleid und Handschuhe sollten für Überlebensoperationen getragen werden. Die präoperative Vorbereitung des Tieres für Überlebensoperationen ist in dem folgenden Protokoll enthalten. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Reagenzien und Geräten.

1. Isolierung und Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus primären Mamma-Tumoren

1. Anästhesieren Sie Spender weibliche 100 Tage alte transgene MMTV-PyMT (FVB / n) Mäuse und pflegen unter cKontinuierliche Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit einem abwesenden Fußrastenreflex richtig betäubt wird.
2. In einer sterilen Umgebung resezieren primäre Mamma-Tumoren von 100-Tage alten transgenen weiblichen MMTV-PyMT (FVB / n) Mäusen durch Trennen des Brusttumors von der darüber liegenden Haut und dem umgebenden Fettgewebe und / oder Lymphknoten mit steriler Schere. Euthanisieren der anästhesierten Mäuse durch zervikale Versetzung.
3. Mit sterilen Scheren oder einem Skalpell, primäre Primärtumoren manuell in kleine Stücke (~ 1,0 mm ³ ). Platzieren Sie Tumorstücke in 3,0 mg / ml Kollagenase A und 4,0 U / ml DNase I, gelöst in DMEM. Verwenden Sie ~ 10 ml des oben genannten Verdauungsmediums pro 1,0 cm Durchmesser Tumor.
   1. Führen Sie die Verdauung in einer sterilen 25 ml-Flasche mit einem sterilen Rührstab bei ~ 125 U / min und 37 ° C für 40 min.
4. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) zu einer Endverdünnung von 10% und legen Sie die gesamte Mischung auf wEt ice wo es beibehalten wird.
5. Filtriere die verdaute Tumorsuspension durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb in ein 50 mL konisches Röhrchen und verwirre jeden im Sieb verbleibenden Tumor. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 xg bei 4 ° C.
6. Das Pellet in 10 ml DMEM pro 1,0 cm Tumor resuspendieren und durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb filtrieren. Zählzellkonzentration, dann bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren.
7. Pellet in 10% Dimethylsulfoxid mit 90% FBS in einer Konzentration von 2 x 10 ⁷ lebenden Zellen / ml resuspendieren. Spezielle Suspensionen des ganzen Primärtumors bei -80 ° C aufbewahren.

2. Orthotopische Injektion von Mamma-Tumor

1. Teilweise aufgetaute gefrorene primäre Tumorsuspensionen bei 37 ° C, bis das gefrorene Pellet aus dem Kryogenrohr in 20 mL DMEM freigesetzt werden kann und die Zellen zählt. Bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren und Zellen in einem 1: 1 DMEM resuspendieren: Wachstumsfaktor-reduzierte solubilisierte Basalmembranpräparation eXtrahiert aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom bei einer Konzentration von 1 x 10 ⁷ Zellen / ml (siehe Tabelle der Materialien ).
2. Legen Sie die anästhesierte Empfänger weibliche syngene Maus ventrale Seite nach oben und pflegen unter kontinuierlichen Sedierung durch die Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesie-Maske.
3. Sterilisieren Sie die rechte 4. Brustdrüsen-Injektionsstelle mit aerosolisiertem 70% Ethanol und applizieren Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen.
4. 100 μl (1 x 10 ⁶ lebende Zellen aus gefrorenen primären Tumorsuspensionen) in die ungekürzte rechte 4. Brustdrüse der 6 bis 10 Wochen alten weiblichen FVB / n-Maus mit einer 29 g 0,3 mL Insulinspritze injizieren.

3. Chirurgische Resektion des Orthotopischen Mamma-Tumors

1. 38-60 Tage nach der Tumorzellinjektion, Euthanisierungsmäuse, die keine orthotopen Tumorvolumina im Bereich von 172 bis 450 mm ³ Volumen aufweisen (Länge x (Breite ²⁾ ) / 2] (etwa 75% der injizierten Mäuse).
2. Legen Sie anästhesierte Mäuse, die die richtige Tumorgröße ventral nach oben unter kontinuierlicher Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske und bestätigen Sie, dass die Maus korrekt mit einem abwesenden Fußquetschreflex betäubt wird. Tragen Sie Tierarzneimittel auf die Augen zur Verhinderung der Trockenheit, während unter Sedierung.
3. Spray 70% Ethanol zur Sterilisation der chirurgischen Bereich um den primären Tumor, dann wenden Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen.
   HINWEIS: Die Haarentfernung an der chirurgischen Stelle führte zu Hautausschnitten und / oder Infektionen für ~ 5% Mäuse und wurde daher von diesem Schritt ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt).
4. Wie in Abbildung 1C gezeigt , machen Sie einen anfänglichen Hautschnitt mit stumpfen Scheren medial-kaudal zum Tumor.
5. Als nächstes machen Sie eine überlegene Exzision der Haut ( Abbildung 1C ) medial zum Tumor. Achten Sie auf die Notwendigkeit, jede Vaskulatur fe zu kauterisierenDen auf der Haut befindlichen Tumor vor dem Ausbau des Einschnitts.
6. Setzen Sie den Hautschnitt seitlich fort (hinter dem Tumor), dann machen Sie eine überlegene Hautexzision (lateral to tumor) und mediale Exzision (überlegen zum Tumor) ( Abbildung 1C ).
7. Nachdem die Haut in Umfangsrichtung um den Tumor herausgeschnitten worden ist ( Abbildung 1C ), heben Sie die überliegende Haut an den Tumor mit Pinzette, während stumpfes Sezieren der Tumor weg von der Bauchwand Muskulatur und halten die Brustdrüsen intakt.
8. Identifizieren (durch stumpfes Präparieren) und große Gefäße kauterisieren Laufen durch die ^4. und ^5. Brustdrüsen.
9. Verbrauch etwa die Hälfte der ^4. und ^5. Brustdrüsen am Kauterisation Ort des Tumors zu befreien, darüber liegende Haut und Segmente der Brustdrüsen (1C).
10. Im Falle von Blutungen, identifizieren aktiv BlutungenSchiffe und sofort kauterisieren. Wenn mehr als 250 μl Blut verloren gehen, schließen Sie die Maus aus dem Studium und euthanisieren Sie es.
11. Schließen Sie Exzisionsstellen mit Wundklammern mit einem Wundklammerapplikator ( Abbildung 1C ).
    HINWEIS: Entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation mit einem Wundclip-Entferner.
12. Verabreichung von warmer steriler Kochsalzlösung subkutan (4% des Körpergewichts des Tieres) und halten das Tier mit einer Wärmelampe warm. Überprüfe die Tiere alle 5-10 Minuten bei der Erholung von der Anästhesie.
    HINWEIS: Die Verabreichung von entweder Bupivacain oder Lidocain erhöhte die postoperative Mortalität (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die Anzeichen von Schmerzen zeigten (Knicken, unfreiwillig zu bewegen, Bruchlosigkeit) 1 h nach der Operation wurden euthanasiert.
    1. Sobald die Maus vollständig erholt ist, bringen Sie sie an die Gesellschaft anderer Mäuse zurück.

4. Isolierung und Verarbeitung von Blut und Lunge für Durchflusszytometrie und Histologie

1. Bei den Studienendpunkten sollten Mäuse auf verschiedene histopathologische Untersuchungen vorbereitet werden. 90 min vor der Euthanasie geben jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von Bromodeoxyuridin (BrdU, 50 μg / g Mausgewicht) bei einer Konzentration von 6,25 μg / μL in 1x PBS.
   ANMERKUNG: Gefrorene Bestandteile von gelöstem Bromodeoxyuridin werden innerhalb von 1 Monat nach der Herstellung verwendet.
2. 10 min vor der Euthanasie, mit der Maus anästhesiert, sammeln Sie retroorbitales Blut (> 500 μl) unter Verwendung von heparinisierten Kapillarröhrchen und übertragen anschließend auf Röhrchen, die mit Dipottium-EDTA auf Eis gehalten wurden.
3. Zum Entfernen von Lungen und restlichen Brustgewebe, bilden einen Mittellinienschnitt mit einer Schere aus dem Unterleib zu der Mündung der Brust- und Bauchhöhle (2A) zu exponieren, und schälen sich seitlich um die Haut freizulegen , auch die verbleibenden rechten ^4. und ^5. Brust Drüsen
4. Das verbleibende Brustdrüsengewebe verbrauchen und untersuchenUm das primäre Tumor-Nachwachsen auszuschließen, indem man das mit dem Serum beschichtete Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebe durch Hämatoxylin und Eosin (H & E) -Färbung ( ergänzende Abbildung 1 ) bewertet .
5. Um die Lunge zu entfernen, öffne die Bauchwand mit einer Schere zum Zwerchfell, dann test du das Tier, indem du die Bauchaorta abschneide, um Blut vor der Perfusion der Lungen abzulassen ( Abb. 2B -2C ).
6. Schneiden Sie das Zwerchfell entlang der Brustkorb aus einer Bauch-Ansatz, um sicherzustellen, dass die Lunge und Herz zu vermeiden. Dann den Thorax durch Schneiden durch die seitlichen Seiten des Brustkorbes aussetzen ( Abbildung 2D ).
7. Unter Verwendung einer 23-Gauge-Nadel auf einer 20-ml-Spritze, perfuse Lungen mit ~ 5,0 mL DPBS (~ 10 ml / min) durch den rechten Ventrikel des Herzens, bis die Lungen ganz weiß sind ( Abbildung 2E -2F ). Sofort schneiden Sie das Herz von der Hauptvesse abIst das Blut nicht wieder in die Lunge.
8. Damit das Lungengewebe für histopathologische Untersuchungen fixiert und verarbeitet werden kann, injizieren Sie ~ 1,0 ml 10% Formalin bei 4 ° C in die exponierte Trachea-Abschrägungsseite in Richtung der Lunge mit einer 23-Gauge-Nadel ( Abbildung 2G- 2H ). Setzen Sie die Einspritzung ein, sobald die Lungen vollständig ausgedehnt und mit Fixiermittel gefüllt sind ( Abbildung 2I ).
9. Lungen-Lungen-Lappen aus der Trachea und Emersions-Lungengewebe in neutral-gepuffertem Formalin für die anschließende Paraffin-Einbettung oder OCT-Gefriermedium pro Standard-histopathologischen Verfahren.
10. Quantifizierung der metastatischen Belastung in den Lungen durch serielle Abschnitte von FFPE-Lungengewebe und Auswertung von Mikrotomabschnitten (100 μm, dreizehn Abschnitte) durch H & E-Färbung ( Abbildung 1B ).

Ergebnisse

Größer als 75% der Empfängermäuse, die 1 x 10 ⁶ Zellen aus primären Mamma-Tumoren erhalten, die von MMTV-PyMT-Mäusen abgeleitet sind, entwickeln einzelne Mamma-Adenokarzinome im Bereich von 172 bis 450 mm ³ innerhalb von 38-60 Tagen (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die für eine Randomisierung in Frage kommen, werden dann nach der chirurgischen Resektion von Primärtumoren in die Studiengruppen eingeschrieben ( Abbildung 1C ). Prim?...

Diskussion

Änderungen und Fehlersuche:

Wenn der stumpfe Sezierungs-Tumor von der Bauchwand entfernt ist, kann der Tumor an der Bauchwand haften bleiben. Dies wurde bei <5% der mit Tumoren injizierten Mäuse beobachtet (Daten nicht gezeigt). Für Mäuse mit an der Bauchwand anhaftenden Tumoren sollte die Maus euthanasiert werden, da die Resektion ohne primärem Tumorwachstum schwierig ist.

Einschränkungen von Modell / Technik:

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800