Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico<em&gt; De Novo</em&gt; Metástasis del cáncer mamario

Resumen

Los modelos preclínicos que evalúan la terapia adyuvante dirigida a la metástasis del cáncer de mama están ausentes. Para tratar esto, se desarrolló un modelo murino de metástasis de adenocarcinoma mamario pulmonar de novo , en el que se pueden evaluar las terapias administradas en la configuración adyuvante (resección postquirúrgica de tumores primarios) en cuanto a eficacia en el impacto de metástasis pulmonares previamente sembradas.

Resumen

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introducción

Las mujeres en América del Norte tienen un 12% de riesgo de por vida ~ de desarrollar cáncer de mama ^2; Una mayoría de estos individuos tendrán tumores primarios quitados vía cirugía, y dependiendo del subtipo del cáncer, recibirán entonces endocrino, endocrino, quimioterapia y / o radioterapia en el ajuste adyuvante ³ . Entre los ejemplos se incluyen las mujeres diagnosticadas con cánceres receptores hormonales positivos que reciben terapias anti-estrógenos y las mujeres con tumores positivos a HER2 que reciben terapias dirigidas a HER2 con radiación / quimioterapia, mientras que todavía no se dispone de terapias dirigidas para tumores triples negativos ³ . A pesar de los avances en radioterapia, quimioterapia, terapias personalizadas y basadas en hormonas que complementan la resección quirúrgica, la enfermedad se repite en el 30-70% de las mujeres diagnosticadas con enfermedad en estadio II o III ⁴ , ya que las terapias son en gran medida ineficaces para erradicar la enfermedad metastásica en órganos distantes, Pulmón, hueso, bLluvia y / o hígado ⁵ . Esto es especialmente significativo dado que cuando la enfermedad metastásica se produce en ausencia de rebrote del tumor primario, esto implica que las células malignas diseminadas probablemente ya estaban presentes en los órganos secundarios en el momento de la cirugía definitiva. Por lo tanto, se necesitan urgentemente terapias capaces de erradicar o retardar el crecimiento de tumores metastásicos.

Mientras que los modelos de ratón de novo de la carcinogénesis mamaria han sido notablemente informativos en revelar mecanismos que regulan la progresión neoplásica ¹ , los modelos existentes también tienen varias limitaciones. Uno de ellos es el hecho de que los modelos transgénicos de novo típicamente desarrollan tumores primarios en múltiples glándulas mamarias, donde la carga tumoral primaria limita la duración de los estudios. Mientras que el escape de células tumorales primarias y la siembra metastásica probablemente ocurren temprano en la progresión neoplásica en estos modelos, el desarrollo franco de los tumores metastásicos ocurre tarde y dependiendoN el modelo del ratón y el fondo de la cepa, a menudo es parcialmente penetrante ¹ . Esto limita aún más la utilidad de los modelos de novo para el descubrimiento de moléculas que regulan la metástasis en los órganos secundarios y para evaluar la eficacia preclínica de los agentes terapéuticos en el contexto del adyuvante.

Para eludir estas limitaciones, se desarrolló un nuevo modelo autóctono de metástasis de carcinoma mamario a los pulmones. Las hembras transgénicas parentales ( es decir , MMTV-PyMT en el fondo de la cepa FVB / n para los estudios descritos en la presente memoria) que llevan tumores mamarios de novo de fase tardía se envejecen a ~ 100 días ⁶ , momento en el que sus tumores primarios son resecados quirúrgicamente y disociados enzimáticamente en Suspensiones de células individuales. Las suspensiones (1 x 10 ^ { ^6} células) a su vez se explantan ortotópicamente en ratones hembra singénicos receptores de 6-7 semanas de edad, en los que se desarrollan tumores mamarios primarios únicos durante un periodo de 38 a 60 días Figura 1A). En un tamaño de tumor definida (172 450 mm ^3), los ratones receptores son anestesiados y los tumores primarios se quirúrgicamente resecados de tal manera que el nuevo crecimiento del tumor en el sitio quirúrgico se reduce al mínimo, en consonancia con la cirugía en mujeres (Figura 1). En el fondo de la cepa FVB / n, los ratones desarrollan focos metastásicos detectables histológicamente en los pulmones con una penetración del 45% por ~ 115 días después de la cirugía ( Figura 1B ). Con esta latencia extendida de crecimiento tumoral metastático, el modelo está posicionado de forma única para la administración de terapia adyuvante y para elucidar y evaluar la biología subyacente que influye en la progresión metastásica después de la extirpación quirúrgica de tumores primarios.

Protocolo

Los animales utilizados en el siguiente protocolo están cubiertos por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregon, diseñado para cumplir con las regulaciones de la Ley de Bienestar Animal y la Política del Servicio de Salud Pública (PHS).

Mantenimiento de las condiciones estériles: Se deben usar instrumentos esterilizados y entre ratones, deben limpiarse con gasa estéril, enjuagarse con PBS y esterilizar con etanol al 70% durante al menos 15 minutos. Se debe usar una gorra quirúrgica, mascarilla, bata y guantes para las cirugías de supervivencia. La preparación preoperatoria del animal para cirugías de supervivencia se incluye en el siguiente protocolo. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de reactivos y equipos.

1. Aislamiento y preparación de suspensiones de células individuales de tumores mamarios primarios

1. Anestesiar a los ratones transgénicos MMTV-PyMT (FVB / n) femeninos 100 días de edad y mantener bajo cSedación continua mediante la administración de isoflurano al 2% a través de una máscara de anestesia. Confirme que el ratón está correctamente anestesiado con un reflejo ausente del pellizco del pie.
2. En un entorno estéril, se resecan tumores mamarios primarios de ratones transgénicos MMTV-PyMT (FVB / n) de 100 días de edad separando el tumor mamario de la piel su- perativa y del tejido adiposo circundante y / o los nódulos linfáticos usando tijeras estériles. Eutanasia de los ratones anestesiados por dislocación cervical.
3. Con tijeras estériles o un bisturí, pique los tumores primarios manualmente en pequeños trozos (~ 1,0 mm ³ ). Coloque las piezas tumorales en 3,0 mg / ml de colagenasa A y 4,0 U / ml de DNasa I disueltas en DMEM. Utilizar ~ 10 ml del medio de digestión anterior por tumor de 1,0 cm de diámetro.
   1. Realizar la digestión en una botella estéril de 25 ml con una barra de agitación estéril a ~ 125 rpm y 37 ° C durante 40 min.
4. Detener la digestión añadiendo suero bovino fetal (FBS) a una dilución final del 10% y colocar toda la mezcla sobre wY el hielo donde se mantiene.
5. Filtrar la suspensión del tumor digerido a través de un filtro de nylon de 0,7 μm en un tubo cónico de 50 ml y descartar cualquier tumor que permanezca en el colador. Centrifugar el sobrenadante a 300 xg a 4 ° C.
6. Resuspender el gránulo en 10 mL de DMEM por tumor de 1,0 cm y volver a filtrar a través de un colador de nylon de 0,7 mu m. Contar la concentración celular, luego centrifugar a 300 xg a 4 ° C.
7. Resuspender el sedimento en 10% de sulfóxido de dimetilo con 90% de FBS a una concentración de 2 x 10 ⁷ células vivas / ml. Almacenar las suspensiones de células únicas de todo el tumor primario a -80 ° C.

2. Inyección ortotópica del tumor mamario

1. Descongele parcialmente las suspensiones de tumor primario congeladas a 37 ° C hasta que el sedimento congelado pueda ser liberado desde el tubo criogénico en 20 ml de DMEM y contar las células. Centrifugar a 300 xg a 4 ° C y resuspender las células en un 1: 1 DMEM: factor de crecimiento reducido solubilizado preparación de la membrana basal eExtraído del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) a una concentración de 1 x 10 ⁷ células / ml (véase la Tabla de Materiales ).
2. Colocar el lado anastésico del ventrículo femenino del ratón singénico receptor anestesiado y mantener bajo sedación continua administrando isoflurano al 2% a través de una máscara de anestesia.
3. Esterilice el sitio de inyección de 4ª glándula mamaria derecho usando etanol 70% en aerosol y aplicando Poli (vinilpirrolidona) -Iodo con un hisopo de algodón estéril.
4. Inyectar 100 μl (1 x 10 ⁶ células vivas de suspensiones tumorales primarias congeladas) con el lado biselado hacia arriba en la 4ª glándula mamaria no eliminada del ratón femoral FVB / n de 6 a 10 semanas de edad usando una jeringa de insulina de 0,9 ml.

3. Resección quirúrgica del tumor mamario ortotópico

1. 38-60 días después de la inyección de células tumorales, la eutanasia a los ratones que no presentan volúmenes de los tumores ortotópicos que oscilan entre 172 450 mm ³ en volumen [longitud x (anchura ² ) / 2] (alrededor del 75% de los ratones inyectados).
2. Colocar los ratones anestesiados que muestran el tamaño ventral del tumor apropiado hacia arriba bajo sedación continua mediante la administración de isoflurano al 2% a través de una máscara de anestesia y confirmar que el ratón está anestesiado correctamente con un reflejo ausente del pellizco del pie. Aplique el ungüento del veterinario a los ojos para la prevención de la sequedad mientras que bajo sedación.
3. Rocíe 70% de etanol para esterilizar el área quirúrgica que rodea al tumor primario, luego aplique Poly (vinilpirrolidona) -Iodo con un hisopo de algodón estéril.
   NOTA: La depilación en el sitio quirúrgico resultó en excoriaciones cutáneas y / o infecciones en ratones al 5% y, por lo tanto, fue excluida de este paso (datos no mostrados).
4. Como se muestra en la Figura 1C , realice una incisión inicial de la piel utilizando tijeras romas medial-caudales al tumor.
5. A continuación, realizar una excisión superior de la piel ( Figura 1C ) medial al tumor. Preste atención a la necesidad de cauterizar cualquier vasculatura.Eding el tumor localizado en la piel antes de extender la incisión.
6. Continuar la incisión de la piel lateralmente (posterior al tumor), luego realizar una excisión superior de la piel (lateral al tumor), y la excisión medial (superior al tumor) ( Figura 1C ).
7. Después de que la piel ha sido extirpada circunferencialmente alrededor del tumor ( Figura 1C ), levante la piel superpuesta unida al tumor usando un fórceps mientras se disecciona romo el tumor lejos de la musculatura de la pared abdominal y manteniendo las glándulas mamarias intactas.
8. Identificar (por disección romo) y cauterizar grandes vasos que atraviesan las glándulas mamarias 4 ^ª y 5 ^ª .
9. Excise aproximadamente la mitad de la ^4ª y ^5ª glándulas mamarias en el sitio de cauterización para liberar el tumor, la piel y segmentos de las glándulas mamarias ( Figura 1C ).
10. En caso de sangrado, identifique la hemorragia activaLos vasos sanguíneos y cauterizarlos inmediatamente. Si se pierde más de 250 μl de sangre, excluir al ratón del estudio y eutanasiarlo.
11. Cerrar los sitios de escisión con clips de herida utilizando un aplicador de clip de herida ( Figura 1C ).
    NOTA: Retire los clips de herida 10 días después de la cirugía con un removedor de pinza herida.
12. Administrar solución salina estéril caliente por vía subcutánea (4% del peso corporal del animal) y mantener al animal caliente con una lámpara de calor. Compruebe los animales cada 5-10 minutos durante la recuperación de la anestesia.
    NOTA: La administración de bupivacaína o lidocaína aumentó la mortalidad postoperatoria (datos no presentados). Ratones que mostraron signos de dolor (hunching, poco dispuesto a moverse, falta de novio) 1 h después de la cirugía fueron eutanasiados.
    1. Una vez que el ratón se ha recuperado completamente, devuélvalo a la compañía de otros ratones.

4. Aislamiento y procesamiento de sangre y pulmón para citometría de flujo e histología

En los puntos finales del estudio, preparar ratones para varias evaluaciones histopatológicas si se desea. 90 min antes de la eutanasia, dar a cada ratón una inyección intraperitoneal de bromodesoxiuridina (BrdU, 50 μg / g de peso de ratón) a una concentración de 6,25 μg / μl en 1x PBS.
NOTA: Las existencias congeladas de bromodesoxiuridina disuelta se usan dentro de un mes después de la preparación.
1. 10 min antes de la eutanasia, con el ratón anestesiado, recoger sangre retroorbital (> 500 μl) utilizando tubos capilares heparinizados, y posteriormente transferir a tubos recubiertos con EDTA dipotásico mantenido sobre hielo.
2. Para eliminar los pulmones y el restante tejido mamario, hacer una incisión en la línea media con las tijeras de la parte inferior del abdomen a la boca para exponer las cavidades torácica y peritoneal (Figura 2A), y la cáscara de la piel lateralmente para exponer también los restantes derecho 4 y ^{5 de} mamaria Glándulas
3. Excise el resto del tejido de la glándula mamaria y examine it para descartar el nuevo crecimiento del tumor primario mediante la evaluación de tejido de serie seccionada fijado en formalina incluido en parafina (FFPE) por hematoxilina y eosina (H & E) tinción (Figura 1).
4. Para retirar los pulmones, abra la pared abdominal al diafragma con tijeras, luego eutanasia el animal cortando la aorta abdominal para drenar la sangre antes de la perfusión de los pulmones ( Figura 2B- 2C ).
5. Cortar el diafragma a lo largo de la caja torácica de un enfoque abdominal asegurándose de evitar el pulmón y el corazón. Luego, exponga el tórax cortando a través de los lados laterales de la caja torácica ( Figura 2D ).
6. Usando una aguja de calibre 23 en una jeringuilla de 20 ml, perfunda los pulmones con ~ 5,0 ml de DPBS (~ 10 ml / min) a través del ventrículo derecho del corazón hasta que los pulmones se vuelvan completamente blancos ( Figura 2E -2F ). Corte inmediatamente el corazón del vesse principalEs así que la sangre no re-perfundir en el pulmón.
7. Para que el tejido pulmonar sea fijado y procesado para evaluaciones histopatológicas, inyecte ~ 1,0 ml de formalina al 10% a 4 ° C en el lado expuesto del bisel de la tráquea hacia arriba hacia los pulmones usando una aguja de calibre 23 ( Figura 2G - 2H ). Cese la inyección una vez que los pulmones estén completamente expandidos y llenos de fijador ( Figura 2I ).
8. Los lóbulos pulmonares de la tráquea, y la emersión fijan el tejido pulmonar en la formalina neutra-tamponada para la posterior incrustación de parafina o medio de congelación OCT, por procedimientos histopatológicos estándar.
9. Evaluar cuantitativamente la carga metastásica en los pulmones mediante seccionamiento en serie del tejido pulmonar FFPE y evaluar las secciones de microtomo (100 μm, trece secciones), mediante tinción con H & E ( Figura 1B ).

Resultados

Mayor que 75% de los ratones receptores recibieron 1 x 10 ⁶ células de tumores mamarios primarios derivados de ratones MMTV-PYMT, desarrollar adenocarcinomas mamarios individuales varían en tamaño de 172 450 mm ³ dentro de 38-60 días (datos no mostrados). Ratones elegibles para la asignación al azar se inscribieron en grupos de estudio después de la resección quirúrgica de los tumores primarios, como se muestra ( Figura 1C ]. Re...

Discusión

Modificaciones y solución de problemas:

Cuando el tumor de disección romo se aleja de la pared abdominal, el tumor puede permanecer adherente a la pared abdominal. Esto se observó en <5% de ratones inyectados con tumor (datos no mostrados). Para ratones con tumores adherentes a la pared abdominal, el ratón debe ser sacrificado ya que la resección es difícil sin rebrote de tumor primario.

Limitaciones del modelo / técnica:

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800