قياس ونمذجة مقلص التجفيف في الطبقة القرنية البشرية

Summary

توضح هذه المقالة طريقة قياس السلوك تجفيف دينامية والخواص الميكانيكية للالطبقة القرنية عن طريق قياس حل مكانيا نزوح التجفيف في الطائرة من عينات الأنسجة دائرية انضمت إلى الركيزة المطاط الصناعي. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس مدى العلاجات الكيميائية المختلفة تغيير التجفيف والأنسجة الخواص الميكانيكية.

Abstract

الطبقة القرنية (SC) هي طبقة الجلد الأكثر سطحية. الاتصال مع البيئة الخارجية يعني أن هذه الطبقة الأنسجة يتعرض إلى كل من وكلاء تطهير والتغيرات اليومية في الرطوبة المحيطة. وكلاهما يمكن أن يغير من محتوى الماء من الأنسجة. تخفيضات في محتوى الماء من خلل الحاجز شديد أو بيئات منخفضة الرطوبة يمكن أن يغير SC صلابة وتسبب تراكم الضغوط التجفيف. في الظروف القاسية، ويمكن لهذه العوامل يسبب تمزق الميكانيكية للأنسجة. قمنا بتأسيس طريقة الإنتاجية العالية من قياس التغيرات الديناميكية في الخواص الميكانيكية للSC على التجفيف. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس التغيرات في سلوك التجفيف والخواص الميكانيكية للSC مع العلاجات المطهر ومرطب التجميل. ويتحقق ذلك عن طريق قياس التغيرات الديناميكية في حل مكانيا في الطائرة نزوح تجفيف عينات الأنسجة دائرية انضمت إلى الركيزة المطاط الصناعي. في الطائرة نزوح شعاعي ACQuired أثناء التجفيف وبلغ متوسط ​​azimuthally ومزودة الشخصي على أساس نموذج انقباض مرونة الخطي. التغيرات الدينامية في التوتر التجفيف وSC معامل مرونة ويمكن بعد ذلك المستخرج من ملامح نموذج المجهزة.

Introduction

ومعظم الطبقة الخارجية من البشرة، أو الطبقة القرنية (SC) ويتكون من خلايا الخلية القرنية متماسكة محاطة الدهون مصفوفة الغنية ^{1 و 2.} تكوين والهيكلية سلامة SC أمر ضروري للحفاظ على صحة وظائف حاجز ^3، والذي يمنع الغزو من الكائنات الحية الدقيقة ويقاوم كل من القوات الميكانيكية و ⁴ فقدان المياه الزائدة. قدرة منتجات العناية الشخصية للحفاظ على أو تتحلل وظيفة حاجز الجلد هي ذات أهمية كبيرة للرعاية الصحية الجلد وصناعة مستحضرات التجميل ^5. ومن المعروف أن التطبيق اليومي من منتجات العناية الشخصية لتغيير الخواص الميكانيكية للSC ^{6، 7، 8.} على سبيل المثال، يمكن السطحي الواردة في مستحضرات التجميل يسبب زيادة كبيرة في معامل المرونة وتراكمالضغوط التجفيف في SC، وزيادة الميل الأنسجة لقضاء ^{7 و 9.} الجلسرين الواردة في المرطبات ومستحضرات التجميل كلها تقريبا يمكن أن تخفف SC ويقلل من تراكم الضغوط تجفيف ^{8، 10، 11،} مما يقلل من احتمال تمزق الأنسجة.

الطريقة المفصلة في هذه المادة قادرة على قياس السلوك تجفيف دينامية والخواص الميكانيكية للSC التجفيف في البيئات التي تسيطر عليها ^{7 و 8.} سابقا، وقد تجلى هذا الأسلوب لتكون قادرة على توضيح تأثير مستحضرات التجميل المختلفة على تغييرات في السلوك تجفيف دينامية والخواص الميكانيكية للأنسجة SC. ويتحقق ذلك عن طريق قياس الانكماش الناجم عن جفاف الأنسجة SC الإنسان التي انضمت إليها لركيزة المطاط الصناعي لينة، من المناسب نزوح تجفيف مع بسيطةنموذج انقباض، ومن ثم استخراج معامل المرونة وتجفيف الإجهاد من التشكيل الجانبي المجهزة. عند طلب اختبار العينات SC متعددة، وهذه الطريقة يقدم بديلا أكثر السريع لtensometry ذو محورين، تستخدم الأنسجة أقل بشكل كبير ويوفر تجفيف ذات الصلة أكثر الفسيولوجية عن طريق منع تبخر من الجانب السفلي العينة.

Protocol

موافقة معفاة (3002-13) لإجراء البحوث باستخدام عينات الأنسجة التي تم تحديدها دي-وفقا لوزارة الصحة والخدمات الإنسانية اللوائح، 45 CFR 46.101 (ب) منح (4). تلقي الجلد سمك كامل من العمليات الجراحية الاختيارية. في هذه المقالة، مصدر الأنسجة البالغ من العمر 66 عاما قوقازي الثدي للإناث.

1. إعداد Coverslips المرنة المغلفة

1. وفي 20 مل قارورة زجاجية، مزيج 0.107 غرام من Sylgard وكيل 184 علاج مع 5.893 غرام قاعدة. مجموع كتلة خليط هي 6 غرام مع قاعدة لعلاج نسبة عامل من 55: 1.
2. بعد خلط بقضيب الزجاج لضمان التجانس، ضع قارورة زجاجية في غرفة فراغ وديغا لإزالة جميع فقاعات.
3. وضع غطاء زجاجي الانزلاق (55 ملم × 25 ملم) في وسط المغطي تدور. إضافة ~ 1 مل من الخليط على وسط غطاء الانزلاق. استخدام ماصة 5000 ميكرولتر مع نهاية قطع مع مقص. تدور معطف غطاء الانزلاق في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية.
   1. كرر هذه صrocess لخلق 5-6 ركائز.
4. علاج زلات غطاء في فرن لمدة 12 ساعة عند 60 درجة مئوية.
5. استخدام شفرة حلاقة لإزالة جزء من فيلم المطاط الصناعي من ركيزة فداء. استخدام علامة لا تمحى بمناسبة الجانب العلوي من الفيلم المطاط الصناعي والزجاج المكشوفة.
6. جبل العينة على مجهر مقلوب واستخدام الإكسسوارات التركيز عن بعد لتسجيل الفرق في ض الارتفاع بين طائرات التنسيق من علامات اثنين. وهذا يتوافق مع سمك المطاط الصناعي الركيزة، ح.

2. إعداد الطبقة القرنية

1. استخدم حمام مائي أو ساخنة لوحة يحرك لتسخين كوب زجاجي نصف مع الماء منزوع الأيونات (DW) إلى 60 درجة مئوية. داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، تزج الجلد البشري سمك الكامل في الماء لمدة 4 دقائق.
2. على الفور نقل عينة من الجلد إلى دورق يحتوي DW تبريده الى <10 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. نصف ملء كوب يقلل تناثر المواد biohazardous.
3. إزالة الجلد من الكأس، ومكان في طبق بتري، وبلطف عزل البشرة باستخدام زوج من ملاقط أنسجة الأنف عازمة.
4. وضع البشرة معزولة الجانب القاعدي أسفل في طبق بيتري اصطف مع الشاش. ضمان الطبقة القاعدية هي تماما في اتصال مع الشاش.
   1. نقع الشاش في 0.25٪ (وزن / المجلد) اكتب IX-S البنكرياس الخنزيري حل التربسين حل في 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 6-8 ساعات في درجة حرارة الغرفة. فقط إضافة التربسين كافية في حاوية الرطب الشاش.
5. رفع الشاش مع ملاقط الأنسجة وتطفو في وعاء مملوء جزئيا مع DW. برفق SC إلى فصلها من الشاش.
6. غسل الطبقة القرنية 3-4 مرات في DW لإزالة أنسجة البشرة المتبقية التي لا يزال يعلق على SC.
7. تعويم SC معزولة في حل من 0.4٪ الجلايسين ماكس (فول الصويا) مثبط التربسين في DW. استخدام شاكر لوحة للتحريض على الأنسجة لمدة 10 دقيقة.
8. تطفو SC في طبق بيتري جزئيامليئة DW. استخدام شاكر لوحة للتحريض على الأنسجة لمدة 10 دقيقة.
9. تجفيف ورقة SC معزولة على شبكة بلاستيكية غاية في الدقة لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية، و 40٪ الرطوبة النسبية (RH)).
10. فصل SC من شبكة وقطع عينات دائري R = 3 مم دائرة نصف قطرها الفردية باستخدام لكمة ثقب دائري. علامة وسط الوجه قصوى مع علامة دوامة صغيرة باستخدام علامة لا تمحى. وهذا يوفر جديلة البصرية للاعتراف الجانب العلوي من SC.
    ملاحظة: يجب تطبيق أثرا لا يمحى في وسط العينة، حيث التشوهات تجفيف ستكون أصغر. وهذا التقليل من تأثير علامة على ملامح التشرد تجفيف المسجلة.

3. عينة من العلاج وترسب

1. تستنهض الهمم عينات SC لمدة 30 دقيقة في 15 مل DW تحتوي على 90 ميكرولتر الخرز علامة فلوري (505/515 نانومتر، 1 ميكرون القطر، الكربوكسيل-تعديل). هذه الودائع الخرز على سطح SC
   ملاحظة: على الرغم من ترسب لأرقام الدو من الخرز على SC قد تجفيف بطيئة بشكل هامشي بالنسبة لعينات دون الخرز الحالي ^12، وسوف تعظيم القرار المكانية من حقول تشوه في الطائرة التي يمكن الحصول عليها في وقت لاحق. ولذلك ينبغي أن يتم اختيار حجم حبة أضاف مخصصة.
2. إزالة عينات SC ووضعها في طبق بيتري مملوءة جزئيا مع DW.
3. تزج جزئيا ركيزة في DW في زاوية الضحلة من 15-30 درجة.
4. يعلقون على حافة العينة SC عائمة في خط التماس بين الركيزة واجهة المياه. سحب عموديا الركيزة من الماء وصفح بسلاسة العينة SC إلى الركيزة دون تجاعيد أو فقاعات الهواء المحبوسة.
5. كرر الخطوة 3.4 لوضع ما يصل إلى 6 عينات SC على كل الركيزة. ترك ما لا يقل عن فجوة 2-3 ملم بين العينات وتجنب عينة التصفيح على مقربة من حافة الركيزة. هذا يمنع جفاف عينة واحدة تؤثر على النزوح التجفيف في بلد آخر.
6. تجفيف العينات SC تقام في ظروف المختبر لمدة 60 دقيقة. وهذا يسمح المياه المتبقية بين SC والركيزة لتتبخر ويضمن التصاق الأنسجة كاملة.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، وعينات SC يمكن معالجتها بمادة كيميائية أو التركيبات التجميلية ^{7 و 8} عن طريق وضع ركائز رأسا على عقب في الحل المنشود للفترة الزمنية المحددة. يتم تنفيذ كرر الخطوة 3.6 مرة واحدة الخطوة العلاج. بعد التجفيف، والتصاق غير مكتمل من عينات SC إلى الركيزة يمكن التحقق باستخدام تنتقل عن طريق المجهر الضوئي. سوف فقاعات محاصرين تحت عينة SC أو حواف delaminated تشكل الاختلافات النقيض من ذلك واضحة في العينة مع حواف محددة جيدا.
7. إنشاء غرفة الرطوبة عن طريق وضع طبق بتري مملوءة جزئيا مع الماء في وعاء مغلق بإحكام.
8. مكان ركائز في غرفة لمدة 24 ساعة لكي تتوازن إلى الرطوبة النسبية من 99٪. لا تضع ركائز إلى بيترط طبق.

4. التحكم البيئي مجهر

1. تحقيق السيطرة على الظروف البيئية من خلال نظام مراقبة الرطوبة متصلة المجهر غرفة نضح ركوب. وترد تفاصيل نظام التحكم في الرطوبة في الألمانية وآخرون. (2013) ⁽⁷⁾ وليو والألمانية (2015) ^(8).
2. جبل الركيزة على المجهر، ووضع غرفة نضح على الركيزة وختم حواف غرفة نضح إلى المطاط الصناعي باستخدام الشحوم فراغ.
3. شنت مرة واحدة، تتوازن الهواء الداخلي إلى 99٪ RH قبل التجريب. هذا يمنع تبخر الماء قبل التجريب. وبمجرد أن بدأت التصوير في أقسام 5 أو 7، والحد من الرطوبة الجوية الداخلية إلى القيمة المطلوبة.
   ملاحظة: في هذه المقالة، يتم تجفيفها عينات SC إلى 25٪ RH

5. التصوير في الطائرة تجفيف نزوح

1. الحصول على صور من عينات SC باستخدام microsco مقلوبالمؤسسة العامة مع 1X عدسة الهدف. تثير حبات الفلورسنت باستخدام محرك خفيف مع فلتر FITC (503-530 نانومتر ممر الموجة الانبعاث). عينات متعددة يمكن تصوير بالتتابع في جميع أنحاء التجفيف باستخدام مرحلة س ص الآلي.
2. فلوري سجل والصور الضوئية التي تنتقل عن طريق استخدام كاميرا CCD الرقمية بدرجة وضوح 1392 X 1040 بكسل. مجال الرؤية من كل صورة هو 8.98 س 6.71 ملم، والسماح لصورة واحدة لالتقاط عينة SC كاملة. التقاط صور مع تردد من 10 دقيقة لمدة 16 ساعة.

6. إعداد الركيزة لقياس سمك

1. في غطاء الدخان الكيميائية، ضع 1 مل سيلاني (3-aminopropyltriethoxysilane، ≥98٪) في بعض غطاء بلاستيكي صغير. وضع ركائز المطاط الصناعي من الباب 1 والحد الأقصى في حاوية مغلقة لمدة 5 ساعات. لا تسمح ركائز أن يأتي على اتصال مباشر مع سيلاني.
2. اضافة 5 ملغ من EDC (N - (3-Dimethylaminopropyl) - N هيدروكلوريد -ethylcarbodiimide، ≥99٪) في أنبوب 1.5 مل. إضافة 500 ميكرولتر من DW إلى EDC. تستنهض الهمم الحل ل10 ثانية مع خلاط دوامة.
3. إضافة 0.076 ز بورات ثنائي الصوديوم و 0.1 ز حمض البوريك إلى 20 مل DW. مزيج باستخدام محرك مغناطيسي عند 70 درجة مئوية (ح 1). إضافة حمض البوريك حتى درجة الحموضة 7.4.
4. إضافة 20 مل من المخزن بورات لأنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 60 ميكرولتر من 1 ميكرون الخرز (535/575 نانومتر، المعدلة الكربوكسيل) إلى المخزن المؤقت بورات. أخيرا، إضافة 200 ميكرولتر من EDC حل للزجاجة. هز أنبوب لخلط حل حبة ثم تصب في 10 سم القطر طبق بيتري.
5. إزالة ركائز silanated من الحاوية ووضعها المطاط الصناعي في جانب فيلم وصولا إلى الحل حبة. تفعل ذلك ببطء لمنع الفقاعات من أن تصبح المحاصرين. واثنين من ركائز يصلح في كل طبق بتري.
6. ترك ركائز لتطفو في حل حبة لمدة 45 دقيقة.
7. استخدام ملاقط لإزالة ركائز من الحل حبة، ثم يشطف في DW لإزالة حبات غير منضم.
8. الهواء الجاف ركائز. تهب الهواء المضغوط علىسطح الفيلم المطاط الصناعي يقلل من تكوين بقع الماء.
9. ختم ركائز في مربع مبهمة لمنع الصور وتبييض من الخرز حتى عينة SC الترسيب.

7. التصوير سمك SC

1. عينات إيداع SC الدخول إلى الركيزة باستخدام الباب 3. ومع ذلك، نفذ الخطوة 3.1 دون إضافة الخرز الفلورسنت إلى DW. بالإضافة إلى ذلك، تطبيق قطرة 5 ميكرولتر من محلول مخفف الفلورسنت علامة حبة (نانومتر 505/515، 0.1 ميكرون قطر) على سطح كل عينة SC المودعة مع ماصة قبل إكمال الخطوة 3.6.
2. إنشاء قياسات SC سمك باستخدام المجهر مع 40X عدسة الهدف. قياس سمك عينات SC على مر الزمن باستخدام أحد الملحقات التركيز عن بعد لتسجيل الفرق في ض الارتفاع بين الطائرتين حبة طبقة التنسيق الموجود في واجهة SC-التحتية والجانب العلوي من SC.
3. قياس سمك 3 مناطق كل عينة SC خلال فترة التجفيف 3 ساعات. السماكةمن عينات SC تصل قيمة حالة مستقرة ضمن هذا الإطار الزمني ^8.

8. تحديد مقدار ونمذجة الأنسجة التشوه

1. استخدام الجسيمات صورة السرعة بواسطة ¹³ للحصول على حل مكانيا في الطائرة نزوح التجفيف من الصور الفلورية في كل خطوة الوقت المسجل.
2. استخدام MATLAB للحصول على متوسط ​​azimuthally شعاعي والتشريد السمتي لمحات من الميدان النزوح من كل عينة SC متماثلة شعاعيا.
   ملاحظة: مثال بيانات (بعنوان "d.mat ') ورمز MATLAB (بعنوان" التعريف الشخصية-processing.m') الذي ينفذ كل من هذه الخطوة والخطوة 8.3 قدمت في المعلومات الإضافية.
3. تناسب ملامح التشرد شعاعي إلى نموذج ^{7، 8، 14، 15، 16} واصفا تجفيف SC كما تقلص circula مرونة الخطيالقرص ص الوقت سمك، ح _SC، دائرة نصف قطرها R، ومعامل المرونة، E _SC، تلتزم ركيزة مرنة تشوه مع معامل مرونة متفاوتة، E. افترض SC له نسبة بواسون واضحة المعالم وثابتة، ν _SC = 0.4 ^{7 8.} الحصول على أفضل نوبات باستخدام الحد الأدنى أقل نهج الساحات.
   ملاحظة: النموذج المستخدم لتركيب يصف نزوح شعاعي من حيث وظائف بسل المعدلة هي:
   (1)
   مع ، و
   المصطلح يناظر عمق الاختراق التي قدمها،
   .
   يدل على معلمة الركيزة صلابة. صالح عند أحجام العينات هي أكبر بكثير من سمك الركيزة. هنا، المعلمات، و على التوالي دلالة على سمك الركيزة نسبة بواسون. نسبة بواسون للسيليكون المطاط الصناعي الركيزة ¹⁷ هي ν = 0.5.
4. الحصول على المعلمات نموذج ألفا وβ في كل خطوة الوقت من المربعات تناسب من المعادلة (1) الى ملف النزوح شعاعي.
   1. توظيف β المعلمة المناسب للحصول SC مرونة معامل، E _SC، وذلك باستخدام التعبير،
      
   2. استخدام α المعلمة المناسب للحصول على وقت متفاوتة مقلص تجفيف تعزيز بنية الشعس، PSC، وذلك باستخدام التعبير،
      

النتائج

الشكل (1) أ يظهر صورة الفلورسنت تمثيلية من عينة SC المغلفة مع حبات الفلورسنت (القسم 3). يظهر المقابلة التي تنتقل عن طريق صورة ضوئية من العينة في الشكل 1 (ب) مضافين مع مؤامرة جعبة نزوح تجفيف حل مكانيا التي تشكل بعد تجفيف 16 ساعة عند 25٪ RH نظ?...

Discussion

في هذه المقالة، نحن تصف تقنية التي يمكن استخدامها لقياس السلوك تجفيف دينامية والخواص الميكانيكية للSC البشري. وقد أظهرت دراسات سابقة أن هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد آثار الظروف البيئية والمنتجات الكيميائية التي يشيع استخدامها في مستحضرات التجميل ومرطبات على س...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer base	Dow-Corning	1064291
Silicone elastomer Curing Agent	Dow-Corning	1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8803
FluoSpheres Carboxylate 1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8823
FluoSpheres Carboxylate 1 µm nile red fluorescent 535/575	Thermo Fisher	F8819
Trypsin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	T6567
Trypsin inhibitor type II-s	Sigma-Aldrich	T9128
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0294
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P7059
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	E7750
Vortexer mixer	VWR	58816-123
6mm diameter hole punch	Sigma-Aldrich	Z708860
SOLA 6-LCR-SB	Lummencor light engine	No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1x Objective	Nikon Plan UW	MRL00012
CFI Plan Fluor 40x Oil Objective 1.3 na - 0.20mm wd	Nikon Plan Fluor	MRH01401
Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon	MEA53200
Clara-E Camera	Andor	DR-328G-C02-SIL
Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design	Nikon	99888
Ti-S-E Motorized Stage	Nikon	MEC56110