Ölçme ve Modelleme Kontraktil Kurutma İnsan stratum korneumdaki

Özet

Bu makalede, uzamsal bir elastomer bir yüzeye yapıştırılır, dairesel doku örneklerinin düzlem kurutma değiştirmeler çözüldü ölçme dinamik kurutma davranış ve startum corneum'un mekanik özelliklerinin ölçülmesi için bir yöntem tarif eder. Bu teknik, kurutma ve doku mekanik özelliklerini değiştirmek ne kadar farklı kimyasal işlemler ölçmek için kullanılabilir.

Özet

Stratum korneum (SC) en yüzeysel cilt tabakasıdır. dış çevre ile temasını Bu doku katmanı, temizlik maddeleri ve çevre neminin günlük değişimlerine tabi olduğu anlamına gelir; bunların her ikisi de doku su içeriğini değiştirebilir. Şiddetli bariyer disfonksiyonu veya düşük nemli ortamlarda su içeriğinde azalmalar SC sertliği değiştirebilir ve kurutma stresler birikmesini neden olabilir. Aşırı durumlarda, bu faktörler dokunun mekanik kopma neden olabilir. Bu kurutma üzerine SC mekanik özellikleri dinamik değişimleri miktarının bir yüksek verimli bir yöntem oluşturmuştur. Bu teknik kurutma davranış değişiklikleri ve kozmetik temizleyici ve nemlendirici tedaviler ile SC mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilir. Bu bir elastomer bir yüzeye yapıştırılır, dairesel doku örneklerinin uzamsal olarak çözündürülerek düzlem kurutma değiştirmeler dinamik varyasyonları ölçülerek elde edilir. Düzlem bir radyal kayma AKAKurutma sırasında edinilmiş azimut ortalama ve doğrusal elastik kontraktilite modeline dayalı bir profil ile donatılmıştır. Kurutma stres ve SC elastik modülü dinamik değişimler daha sonra monte modeli profilleri elde edilebilir.

Giriş

En dış epidermis tabakası veya Stratum corneum (SC), bir lipid bakımından zengin matris ^{1, 2} çevrili uyumlu korneosit hücrelerden oluşur. SC bileşimi ve yapısal bütünlüğü mikroorganizmalardan istilasını engeller ve mekanik kuvvet ve aşırı su kaybı ⁴ hem dayanıklı doğru engelleyici özelliğe ³ korumak için gereklidir. Korumak veya cildin bariyer fonksiyonunu aşağılamak için kişisel bakım ürünleri kapasite cilt sağlık ve kozmetik sanayi ⁵ büyük ilgi olduğunu. Kişisel bakım ürünleri günlük uygulama SC ^{6, 7, 8} mekanik özelliklerini değiştirmek için bilinmektedir. Örneğin, kozmetik temizleyiciler içinde ihtiva yüzey aktif maddeler önemli ölçüde elastik modül artış ve bir oluşmasına neden olabilirdokusunun eğilimini artırarak SC kurutma gerilmeler, ^{9, 7} çatlamak. Neredeyse tüm kozmetik nemlendiriciler bulunan gliserol SC yumuşatmak ve doku yırtılması olasılığını azaltarak kuruma gerilmeler ^{8, 10, 11,} birikmesini azaltabilir.

Bu makalede açıklanan yöntem, dinamik kurutma davranış ve kontrol ortamları ⁷ SC kurutma mekanik ^{özellikleri, 8} miktarının yeteneğine sahiptir. Daha önce, bu teknik dinamik kurutma davranış değişiklikleri ve SK doku mekanik özellikleri farklı kozmetik ürünlerin etkisini açıklık yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu basit bir ile kurutma yer değiştirmeleri uydurma, yumuşak bir elastomer yüzeye yapıştırılır insan SC dokusunun kuruma kaynaklı büzülme miktarının elde edilirkontraktilite modeli ve ardından elastik modülü ayıklanması ve monte profilden stres kurutulması. Birden SC örneklerinin test edilmesi gerekmektedir, bu yöntem, tek eksenli tensometry için daha hızlı bir alternatif, daha az doku kullanır ve örnek alt buharlaşma önleyerek daha fazla fizyolojik olarak uygun kurutma sağlar sunmaktadır.

Protokol

Bir muaf onayı (3002-13) CFR 46,101 45 (b) (4) verildi, de tanımlanan Sağlık Bakanlığı'na göre doku örnekleri ve İnsan Hizmetleri düzenlemeleri kullanarak araştırma yürütmek için. Tam kat deri elektif cerrahi alınır. Bu makalede, doku kaynağı 66 yaşındaki Kafkas kadın meme olduğunu.

Elastomer Kaplı lameller hazırlanması 1.

1. 20 mL'lik bir cam şişeye, 5,893 g baz ile Sylgard 184 sertleştirme maddesinin 0.107 g karıştırın. toplam karışım kütlesi 55 ajan oranı kür için bir baz ile 6 gr: 1.
2. homojenliği sağlamak için bir cam çubuk ile karıştırma sonra tüm kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum bölmesi ve gazını cam şişe yerleştirin.
3. bir eğirme kaplayıcı merkezinde bir cam kapak-slip (55 mm x 25 mm) yerleştirin. kapak kayma merkezi üzerine karışımı ~ 1 ml ekleyin. makasla kesilmiş ucu ile 5000 mcL pipet kullanın. Spin kat 60 saniye süreyle 2,000 rpm'de kapak-slip.
   1. Bu p tekrarlayınroses 5-6 yüzeyler oluşturmak için.
4. 60 ° C'de 12 saat boyunca bir fırın içinde kapak slipleri Cure.
5. kısmen kurban substrattan elastomer filmi kaldırmak için bir jilet kullanın. elastomer film ve maruz cam topside işaretlemek için silinmez bir kalem kullanın.
6. ters bir mikroskop örnek monte edin ve iki işaretleri odak düzlemleri arasındaki z yükseklik farkını kaydetmek için bir uzaktan odak aksesuarını kullanın. Bunun, elastomer tabaka kalınlığı, h karşılık gelir.

Stratum corneum'un 2. Hazırlık

1. 60 ° C yarım deiyonize su (DW) ile doldurulmuş, cam kabı ısıtmak için bir su banyosu ya da ısıtılmış bir karıştırma plakası kullanın. biyolojik güvenlik kabini içinde, 4 dakika boyunca suda tam kat insan derisini batırmayın.
2. Hemen DW 4 dakika boyunca 10 ° C
3. bükülmüş burunlu doku bir cımbız kullanarak epidermis izole hafifçe bir Petri kabındaki beher, yerden deri kaldırmak ve.
4. gazlı bez ile kaplı bir Petri kabındaki aşağı izole epidermis bazal tarafını yerleştirin. bazal tabaka tamamen gazlı bez ile temas halinde olduğundan emin olun.
   1. % 0.25 (ağırlık / hacim), oda sıcaklığında, 6-8 saat boyunca, 0.1 M fosfat tamponlu tuzlu su içinde eritilmiş IX-S, domuz pankreas tripsin solüsyonu türü gazlı bekletin. tül ıslak kapta yalnızca yeterli tripsin ekleyin.
5. Doku cımbız ile gazlı bez kaldırın ve kısmen DW ile dolu bir kap içinde yüzer. Yavaşça gazlı ayırmak için SC çekin.
6. SC bağlı kalır bakiye epidermal doku kaldırmak için DW stratum corneum 3-4 kez yıkayın.
7. DW% 0.4 Glycine max (soya fasulyesi) tripsin inhibitörü çözeltisi izole SC Float. 10 dakika boyunca doku ajite bir plaka çalkalayıcı kullanın.
8. kısmen Petri kabındaki SC FloatDW ile dolu. 10 dakika boyunca doku ajite bir plaka çalkalayıcı kullanın.
9. oda sıcaklığında 48 saat süre ile ultra ince plastik ağ izole SC tabaka kurutulur (25 ° C,% 40 bağıl nem (RH)).
10. mesh SC ayırın ve yuvarlak bir delik yumruk kullanarak bireysel dairesel R = 3 mm yarıçaplı örnekleri kesip. Mark silinmez bir kalem kullanarak küçük bir sarmal işareti dışarıdaki yüz merkezi. Bu SC topside tanımak için görsel bir ipucu sağlar.
    NOT: silinmez işareti kurutma deformasyonlar küçük olacak numunenin merkezinde, uygulanmalıdır. Bu kaydedilen kurutma deplasman profilleri üzerinde işaretleyici etkisini en aza indirecektir.

3. Numune Tedavi ve Biriktirme

1. 90 uL, floresan markör boncuk içeren 15 ml DW 30 dakika boyunca SC örnekleri karıştırın (505/515 nm, 1 mikron çapında, karboksilat-değiştirilmiş). Bu mevduat SC yüzeyine boncuk
   Not: birlikte l çökelmesiSC boncuk arge sayılar, sonradan elde edilebilir düzlem deformasyon alanları uzaysal çözünürlüğü boncuklar mevcut ¹² olmadan numunelerin marjinal yavaş kuruma göreli maksimize edecek olabilir. Ilave tanecik hacmi seçimi bu nedenle özel yapılmalıdır.
2. SC örnekleri çıkarın ve kısmen DW ile dolu bir Petri kabındaki koyun.
3. Kısmen 15-30 ° sığ bir açıyla DW bir substratı batırmayın.
4. substrat ve su arayüzü arasındaki temas hattında yüzen SC numunenin bir kenar sabitleyin. Dikey sorunsuz kırışıklıklar ya da sıkışan hava kabarcığı olmadan substrata SC örnek laminat olacaktır sudan substratın çekilmesi.
5. Adımı yineleyin 3.4 her yüzey üzerine 6 SC örneklerinin kadar koyun. numuneler arasında en az 2-3 mm boşluk bırakın ve yüzey kenarına yakın örnek laminasyon kaçının. Bu başka bir örnek etkileyen kurutma değiştirmeler kurumasını engeller.
6. 60 dakika boyunca laboratuvar koşullarında monte SC örnekleri kurulayın. Bu SC ve alt tabaka arasındaki artık su buharlaşmaya izin verir ve tam doku yapışmasını sağlar.
   Not: Bu noktada, SC örnekleri zaman gerekli bir süre için istenen bir çözelti içinde alt üst tabakaları yerleştirerek bir kimyasal ya da kozmetik formülasyonlarda ^{7, 8} ile birlikte tedavi edilebilir. Tedavi aşamasında bir kez adımı yineleyin 3.6 gerçekleştirilir. Kurutma işleminden sonra, alt-tabaka SC örneklerinin tam olmayan yapışma geçen ışık mikroskobu kullanılarak kontrol edilebilir. SC numune veya delamine kenarları altında sıkışıp kabarcıklar iyi tanımlanmış kenarları numunedeki net kontrast varyasyonları oluşturacaktır.
7. kısmen hava geçirmez şekilde kapatılmış bir kap içinde su ile dolu bir Petri kabı yerleştirerek bir rutubet gözünün oluşturun.
8. 24 saat boyunca bölme içine bir yer alt-tabakalar% 99 nispi neme dengelenmeye. Petr içine substratlar koymayınBen çanak.

4. Mikroskop Çevresel Kontrol

1. Bir mikroskop monte perfüzyon odasına bağlı bir nem kontrol sistemi ile çevresel koşulların kontrolünü elde edin. Nem kontrol sistemi ayrıntıları ve ark Almanca verilmiştir. (2013) ⁷ ve Liu ve Alman (2015) ^8.
2. , Mikroskop alt tabakayı monte alt tabaka üzerine perfüzyon odasına yerleştirin ve vakum gres kullanarak elastomer perfüzyon odasının kenarları mühür.
3. Bir kez monte önce deneye% 99 RH iç hava dengelenmesi. Bu deney öncesinde suyun buharlaşmasını önler. bölümleri 5 veya 7 görüntüleme başladıktan sonra, istenen değere iç hava nemi azaltır.
   NOT: Bu yazıda, SC örnekleri% 25 RH kurutulur

Düzlem Kurutma Ötelenmeler 5. Görüntüleme

1. ters bir microsco kullanarak SC örneklerinin görüntülerini elde1X objektif lens ile pe. FITC filtresi (503-530 nm emisyon bant geçişi) ile hafif bir motoru kullanarak floresan boncuk Excite. Çoklu numuneler otomatik xy sahne kullanarak kuruma boyunca sırayla görüntülenebilir.
2. Kayıt floresan ve 1392 x 1040 piksel çözünürlükte bir dijital CCD kamera kullanılarak iletilen ışık görüntüler. her görüntünün görüş alanı tam SC örneği yakalamak için tek bir görüntü sağlayan 8.98 x 6.71 mm vardır. 16 saat 10 dakikalık bir frekans ile görüntü alabilir.

Kalınlığı Ölçüm 6. Yüzey Hazırlığı

1. Bazı küçük plastik kap, bir kimyasal davlumbaz, 1 ml silan (≥98% 3-aminopropiltrietoksisilan) yerleştirin. Bölüm 1 ve 5 saat için bir sızdırmaz kılınmış bir kap içinde kapağından elastomer tabakaları yerleştirin. substratlar silan ile doğrudan temas etmesine izin vermeyin.
2. 1.5 ml bir tüp içinde (≥99% etilkarbodiimid hidroklorid - - (3-Dimetilaminopropil) N) 5 EDC mg ekleyin. 50 ekleEDC için DW 0 uL. vorteks karıştırıcı ile 10 saniye için çözüm çalkalayın.
3. 20 ml DW 0.076 g sodyum tetraborat ve 0.1 g borik asit ekleyin. 70 ° C'de (1 saat), bir manyetik karıştırıcı kullanılarak karıştırılır. pH 7.4 olana kadar borik asit ekleyin.
4. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne borat tamponu 20 mL ekleyin. borat tamponu 1 um boncuk (535/575 nm, karboksilat ile modifiye edilmiş) 60 ul ekle. Son olarak, 200 uL EDC çözüm şişe ekleyin. 10 cm çapında Petri kabı içine dökün sonra boncuk çözüm karıştırmak ve tüp sallayın.
5. kaptan silanlanmış substratları çıkarın ve onları boncuk çözeltisi içine aşağı film tarafı elastomer yerleştirin. sıkışma kabarcıklarını engellemek için çok yavaş yapın. İki substrat her Petri kabındaki uyacaktır.
6. 45 dakika boyunca damla çözeltisi içinde yüzer tabakaları bırakın.
7. Daha sonra, boncuk çözeltisinden yüzeyler kaldırmak bağlanmamış boncuk kaldırmak için DW durulama için cımbız kullanın.
8. Hava yüzeyler kurutun. üzerinde basınçlı hava üflemeelastomer film yüzeyi su lekeleri oluşmasını azaltır.
9. SC örnek birikimi kadar boncuk foto-ağartma önlemek için bir opak kutuya yüzeylerde Seal.

SC 7. Görüntüleme Kalınlığı

1. Ancak bölüm 3. kullanarak bir alt tabaka üzerine Mevduat SC örnekleri, DW floresan boncuk eklemeden adımı 3.1 gerçekleştirin. Buna ek olarak, adım 3.6 tamamlamadan önce bir pipetle her bir biriktirilmiş SC numunenin yüzeyine seyreltilmemiş floresan markör boncuk çözeltisi (505/515 nm, 0.1 mikron çapında) içindeki bir 5 uL damla uygulanır.
2. 40X objektif lens ile mikroskop kullanılarak SC kalınlığı ölçümlerini kurmak. SC-substrat arayüzü bulunan iki boncuk tabaka odak düzlemleri ve SC üst tarafında arasındaki z yükseklik farkını kaydetmek için bir uzaktan odak aksesuarını kullanarak zamanla SC örneklerinin kalınlığını ölçün.
3. 3 saat kuruma süresi boyunca her SC örnek 3 bölgelerin kalınlığı ölçülür. KalınlıkSC örnekleri bu zaman dilimi ⁸ içinde kararlı durum değerine ulaşır.

8. ükler ve Modelleme Doku Deformasyon

1. Kaydedilen her zaman adımında floresan görüntüleri mekansal çözülmesi düzlem kurutma deplasmanları elde etmek için parçacık görüntüleyerek hız ölçümü ¹³ kullanın.
2. Her radyal simetrik SC numunenin deplasman alanından azimut ortalama radyal ve azimuthal deplasman profilleri elde etmek için MATLAB kullanın.
   NOT: Bir örnek veri kümesi (başlıklı 'd.mat') ve bu adımı ve adımı 8.3 hem de gerçekleştiren MATLAB kodu (başlıklı 'PIV-processing.m') ek bilgi sağlanmıştır.
3. Bir küçülen doğrusal elastik dolaşım sistemlerini olarak kuruma SC açıklayan bir model ^{7, 8, 14, 15, 16} radyal deplasman profilleri FitE. SC varsayalım bir esneme modülü olan bir deforme olabilir esnek bir yüzeye yapıştırılır kalınlığı H _SC, çapındaki, Rı ve elastik modülü, E _SC, değişen zaman R disk iyi tanımlanmış ve sürekli Poisson oranı, ν _SC = 0.4 ^{7 8.} Minimum en küçük kareler yaklaşımı kullanarak en iyi uyuyor edinin.
   NOT: montaj için kullanılan model modifiye Bessel fonksiyonları açısından radyal yer değiştirmelere açıklar gibidir:
   (1)
   ile , ve
   Dönem tarafından verilen penetrasyon derinliğine karşılık gelir,
   .
   Bir alt-tabaka sertliği parametresini gösterir; geçerli örnek boyutları alt tabaka kalınlığının çok daha büyük olduğunda. Burada, parametreler, ve sırasıyla substrat kalınlığı Poisson oranı ifade etmektedir. Silikon elastomer substrat ¹⁷ Poisson oranı ν = 0.5 olduğunu.
4. Model parametreleri radyal yer değiştirme profilinin Eşitlik (1) arasında uygun en küçük kareler, her adımda a ve β elde edilir.
   1. Ifadesini kullanarak, SC elastik modülü, E _SC elde etmek için uydurma parametre p istihdam
      
   2. kasılma kurutma stre değişen zaman elde uydurma parametre a'yı kullanınss, PSC, ifadesini kullanarak,
      

Sonuçlar

Şekil 1 (a) flüoresan boncuklar (bölüm 3) ile kaplı bir SC numunenin temsili bir floresan görüntü gösterir. Örnek mukabil geçen ışık görüntü (b) 'Bağlı örneklerin dairesel simetriye% 25 bağıl nemde 16 saat kurutulduktan sonra meydana uzamsal olarak çözündürülerek kurutma değiştirmeler bir titreme arsa ile kaplanmış 1, Şekil' de gösterilmiştir, bu yer değiştirmeler azimut olabilir ortalama.

Tartışmalar

Bu yazıda, dinamik kurutma davranışları ve insan SC mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Daha önce yapılan çalışmalar, bu teknik, genel olarak SC ^{7, 8} dinamik kuruma davranışı üzerindeki kozmetik temizleyiciler ve nemlendiriciler kullanılan çevre koşulları ve kimyasal ürünlerin etkisini ölçmek için kullanılabileceğini gösterdiler. protokolde önemli adımlar vardır. Birincisi, SC su içeriği ile öz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer base	Dow-Corning	1064291
Silicone elastomer Curing Agent	Dow-Corning	1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8803
FluoSpheres Carboxylate 1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8823
FluoSpheres Carboxylate 1 µm nile red fluorescent 535/575	Thermo Fisher	F8819
Trypsin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	T6567
Trypsin inhibitor type II-s	Sigma-Aldrich	T9128
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0294
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P7059
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	E7750
Vortexer mixer	VWR	58816-123
6mm diameter hole punch	Sigma-Aldrich	Z708860
SOLA 6-LCR-SB	Lummencor light engine	No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1x Objective	Nikon Plan UW	MRL00012
CFI Plan Fluor 40x Oil Objective 1.3 na - 0.20mm wd	Nikon Plan Fluor	MRH01401
Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon	MEA53200
Clara-E Camera	Andor	DR-328G-C02-SIL
Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design	Nikon	99888
Ti-S-E Motorized Stage	Nikon	MEC56110