計測とモデリング収縮乾燥ヒト角質層で

要約

この記事では、エラストマー基板に付着した円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位を測定することにより、動的な乾燥挙動と角質層の機械的特性を定量化する方法について説明します。この技術は、化学的処理、乾燥及び組織の機械的特性を変化させる方法の異なる測定するために使用することができます。

要約

角質層（SC）は、ほとんどの表皮層です。外部環境との接触は、この組織層が、洗浄剤および周囲湿度で毎日変動の両方に供されることを意味します。その両方は、組織の水分含有量を変化させることができます。重度のバリア機能不全または低湿度環境からの水分含有量の減少は、SCの剛性を変化させ、乾燥ストレスの蓄積を引き起こす可能性があります。極端な条件では、これらの要因は、組織の機械的破壊を引き起こす可能性があります。私たちは、乾燥時にSCの機械的特性の動的変化を定量化するハイスループット法を確立しました。この技術は、乾燥挙動の変化や化粧品洗浄剤と保湿剤治療とSCの機械的特性を定量化するために使用することができます。これは、エラストマー基材に接着円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位における動的変化を測定することによって達成されます。面内の半径方向の変位ACQ乾燥中uired方位角を平均し、線形弾性収縮モデルに基づいてプロファイルが備わっています。乾燥ストレス及びSC弾性率の動的変化は、次に、当てはめモデルプロファイルから抽出することができます。

概要

最も外側の表皮の層、または角質層（SC）は、脂質が豊富なマトリックス^1、2に囲まれた凝集角質細胞の細胞からなります。 SCの組成と構造的完全性は、微生物からの侵入を防ぎ、機械的な力と過度の水分損失⁴の両方に抵抗する正しいバリア機能^3を 、維持するために必須です。皮膚のバリア機能を維持又は低下させるためにパーソナルケア製品の容量は、皮膚、医療および化粧品産業⁵に大きな関心があります。パーソナルケア製品の毎日の適用はSC ^6、7、8の機械的特性を変化させることが知られています。例えば、化粧品の洗浄剤に含まれる界面活性剤は、弾性率とのビルドアップの大幅な増加を引き起こす可能性があります、SC内の応力を乾燥^7をクラックする組織の傾向を増加させること^、9。ほぼすべての化粧料の保湿剤に含まれるグリセロールは、SCを柔らかくし、組織破壊の可能性を減少させる、乾燥ストレス^8、10、11の蓄積を減少させることができます。

この記事では詳細な方法は、動的な乾燥挙動と制御された環境^7、8でSC乾燥の機械的特性を定量化することが可能です。以前に、この技術は、動的な乾燥挙動の変化やSC組織の機械的性質の異なる化粧品の効果を解明することができることが実証されています。これは、単純で乾燥変位フィッティング、ソフトエラストマー基質に付着ヒトSC組織の乾燥誘導性の収縮を定量化することによって達成されます。次に収縮モデル、及び弾性係数を抽出し、嵌合プロファイルから応力を乾燥。複数SC試料の検査が必要な場合、この方法は、一軸tensometryのより迅速な代替手段を提供する著しく少ない組織を利用し、試料裏面からの蒸発を防止することにより、より生理学的に適切な乾燥を提供します。

プロトコル

保健省とヒューマンサービスの規制に準拠する非識別組織サンプル、45 CFR 46.101（b）は（4）が付与されたを使用して研究を行うための免除の承認（3002から13）。全層皮膚を待機手術から受信されます。この記事では、組織供給源は、66歳の白人女性の胸です。

エラストマーコーティングされたカバーガラスの作製

1. 20mLのガラスバイアルにおいて、5.893グラムベースでのSylgard 184硬化剤の0.107グラム混ぜます。 1：全混合物の質量は55のエージェントの比率を硬化する塩基で6グラムです。
2. 均質性を確実にするためにガラス棒を用いて混合した後、すべての気泡を除去する真空チャンバと脱ガスガラスバイアルを置きます。
3. スピンコーターの中心にガラスカバースリップ（55ミリメートル×25 mm）を配置します。カバースリップの中央に混合物の約1 mLを加え。ハサミで切断端と5,000μLピペットを使用してください。スピンコート60秒間2,000 rpmでカバースリップ。
   1. このPを繰り返し5-6の基板を作成するrocess。
4. 60℃で12時間、オーブンでカバーグラスを治します。
5. 部分的に犠牲基板からエラストマー膜を除去するためにカミソリの刃を使用してください。エラストマーフィルムと露出したガラスの上側をマークするために、消えないマーカーを使用してください。
6. 倒立顕微鏡でサンプルをマウントし、2つのマークの焦点面との間のz高さの差を記録するために、リモートフォーカスアクセサリを使用しています。これは、エラストマー基板の厚さ、hに対応します。

角質層の調製

1. 半分を60℃に、脱イオン水（DW）を充填したガラスビーカーを加熱するために水浴または加熱撹拌プレートを使用してください。生物学的安全キャビネットの内部には、4分間水中での全厚ヒトの皮膚を浸します。
2. すぐにDWは4分間、<10℃に冷却含むビーカーに皮膚サンプルを転送します。ビーカーを埋める半分は生体有害物質の飛散を最小限に抑えます。
3. 曲がった鼻の組織ピンセットを用いて表皮を分離優しくペトリ皿でビーカー、場所から肌を削除し、。
4. ガーゼを敷いたペトリ皿に分離された表皮基底側を下に置きます。基底層が完全にガーゼと接触していることを確認します。
   1. 0.25％（重量/容量）を室温で6-8時間、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水に溶解したIX-Sブタ膵臓トリプシン溶液を入力中にガーゼを浸し。ガーゼを湿らせる容器に十分なだけのトリプシンを追加します。
5. 組織ピンセットでガーゼを持ち上げて、部分的にDWを充填した容器の中に浮かんでいます。ゆっくりガーゼからそれを分離するためにSCを引きます。
6. SCに付着したまま残留表皮組織を除去するために、DWで角質層3-4回洗浄します。
7. DWで0.4％グリシンマックス（大豆）トリプシン阻害剤の溶液中に単離されたSCフロート。 10分間組織を攪拌するプレートシェーカーを使用してください。
8. 部分的にペトリ皿にSCフロートDWで満たされました。 10分間組織を攪拌するプレートシェーカーを使用してください。
9. 室温で48時間超微細プラスチックメッシュ上に、単離されたSC紙を乾燥（25℃、40％相対湿度（RH））。
10. メッシュからSCを分離し、円形の穴パンチを使用して、個々の円形R = 3mmの半径サンプルを切り出します。マーク消えないマーカーを用いた小型のスパイラルマークの付いた一番外側の面の中心。これは、SCの上側を認識するための視覚的な手がかりを提供します。
    注：足跡は、乾燥変形が最小になる試料の中央に適用されるべきです。これは、記録された乾燥変位プロファイル上のマーカーの影響を最小限に抑えることができます。

3.サンプル処理と堆積

1. 90μL蛍光マーカービーズを含む15 mLのDWで30分間SCサンプルを攪拌（505/515 nmで、直径1μm、カルボキシレートは、修飾されました）。 SCの表面にこの預金ビーズ
   注：ながらリットルの堆積SC上のビーズのARGE数は、それが続いて得られる面内変形場の空間分解能をビーズ現在¹²ないサンプルにわずかに遅い乾燥を相対的に最大にすることができます。追加されたビーズ容量の選択は、したがって、 アドホックなされるべきです。
2. SCサンプルを削除し、部分的にDWで満たされたペトリ皿に配置します。
3. 部分的に15-30°の浅い角度でDW内の基板を浸します。
4. 基板と水の界面との間の接触線での浮動SCサンプルのエッジをピン。垂直方向にスムーズにしわや閉じ込められた気泡のない基板へのSCサンプルをラミネートします水から基板を取り出します。
5. 各基板上に6 SCサンプルまでを配置するための手順を繰り返し3.4。サンプルの間に少なくとも2〜3ミリメートルのギャップのままにして、基板エッジに近いサンプルの積層を避けます。これは別のもので、乾燥変位に影響を与える一つの試料の乾燥を防ぐことができます。
6. 60分間実験室条件に搭載SCサンプルを乾燥させます。これは、SCと基板との間の残留水が蒸発することを可能にし、完全な組織接着を確実にします。
   注：この時点では、SCサンプルは時間の必要な期間、所望の溶液中に逆さまに基板を配置することにより、化学的または化粧品配合物^7,8を用いて治療することができます。処理工程が実行されると、ステップ3.6を繰り返します。乾燥した後、基板にSCサンプルの不完全密着は、透過光顕微鏡を用いて確認することができます。 SCサンプルまたは剥離縁下敷き気泡が明確に定義されたエッジを有するサンプル中の明確なコントラスト変動を形成することになります。
7. 部分的に密閉された容器に水で満たされたペトリ皿を置くことによって、湿度室を作成します。
8. 24時間チャンバ内に置き基板は、99％の相対湿度に平衡化します。ペトルに基板を配置しないでください私は皿。

4.顕微鏡環境制御

1. 顕微鏡マウント灌流チャンバーに接続された湿度制御システムを介して環境条件の制御を達成します。湿度制御システムの詳細は、ドイツらに設けられています。 （2013年^）7と劉とドイツ（2015年^）8。
2. 、顕微鏡上に基板をマウント基板上に灌流チャンバーを配置し、真空グリースを使用してエラストマーに灌流チャンバーの端をシールします。
3. 一度取り付けられ、実験前に99％RHに内部の空気を平衡化。これは、実験前に水の蒸発を防ぐことができます。セクション5または7での撮影が始まったら、所望の値に内部の空気の湿度を低下させます。
   注：この記事では、SCのサンプルを25％RHに乾燥しています

飛行機乾燥変位5.イメージング

1. 反転microscoを使用して、SCサンプルの画像を取得1X対物レンズとPE。 FITCフィルター（503から530 nmの放射帯域）の光エンジンを用いた蛍光ビーズを励起します。複数のサンプルは、自動化されたX-Yステージを使用して乾燥を通して連続的に撮像することができます。
2. 1392 X 1040ピクセルの解像度でデジタルCCDカメラを使用して、レコード蛍光と透過光画像。各画像の視野は、完全なSCのサンプルをキャプチャするために単一の画像を可能8.98 X 6.71 mmです。 16時間10分の頻度で画像を取ります。

厚測定のための6基質の準備

1. いくつかの小さなプラスチック製のキャップで、化学ヒュームフードでは、1 mLのシラン（≥98％3-アミノプロピルトリエトキシシラン）を配置。セクション1と5時間密閉容器内キャップからエラストマー基板を配置します。基板は、シランと直接接触して来ないようにしてください。
2. 1.5 mLチューブに、5 EDCのMG（≥99％Nエチルカルボジイミド塩酸塩- - （3-ジメチルアミノプロピル）N）を追加します。 50を追加します。EDCへのDWの0μL。ボルテックスミキサーで10秒のためのソリューションを撹拌。
3. 20 mLのDWに0.076グラムの四ホウ酸ナトリウムおよび0.1グラムのホウ酸を追加します。 70℃（1時間）で、マグネチックスターラーを用いて混合します。 pHが7.4になるまで、ホウ酸を追加します。
4. 50 mL遠心管にホウ酸緩衝液の20 mLを加え。ホウ酸緩衝液に1μmのビーズ（575分の535 nmのカルボン酸で修飾された）の60μLを追加します。最後に、ボトルにEDC溶液200μLを追加します。ビーズ溶液を混合するためにチューブを振って、その後、直径10cmのペトリ皿に注ぎます。
5. コンテナからシラン化基板を取り外し、それらをダウンビーズ溶液中にフィルム側をエラストマー置きます。捕獲されたなってから気泡を防止するために、ゆっくりと行ってください。二つの基板は、各ペトリ皿に収まります。
6. 45分間ビーズ溶液中で浮いているように、基板を残します。
7. 結合していないビーズを除去するために、DWで洗い流した後、ビーズ溶液から基板を除去するためにピンセットを使用します。
8. 空気は、基板を乾燥させます。以上の圧縮空気を吹き付けますエラストマーフィルム表面が水のスポットの形成を減少させます。
9. SCサンプル沈着までビーズの光退色を防ぐために、不透明なボックス内の基板をシール。

SCの7イメージング厚さ

1. ただし部3を用いて基板上へ預金SCサンプルは、DWに蛍光ビーズを追加することなく、ステップ3.1を実行してください。さらに、ステップ3.6が完了する前にピペットを用いて各堆積SC試料の表面に希釈していない蛍光マーカービーズ溶液（505/515 nmで、直径0.1μm）の5μLのドロップを適用します。
2. 40X対物レンズと顕微鏡を使用してSCの厚さの測定値を確立します。 SC-基板界面とSCの上側に位置する2つのビード層の焦点面との間のz高さの差を記録するためにリモートフォーカスアクセサリを用いて経時SC試料の厚さを測定します。
3. 3時間の乾燥期間にわたって各SC試料の3つの領域の厚さを測定します。厚さSC試料のこの時間枠⁸内の定常状態値に達します。

8.定量化とモデリングの組織変形

1. 記録された各時間ステップで蛍光画像から空間分解の面内乾燥変位を得るために、粒子画像流速^13を使用してください。
2. 各放射状に対称SCサンプルの変位場から方位角平均半径方向および方位角の変位プロファイルを得るためにMATLABを使用してください。
   注：例えば、データセット（題する 'd.mat'）と、この工程および8.3の両方を実行するMATLABコード（題する「PIV-processing.m '）は補足情報で提供されています。
3. 収縮線形弾性circulaとして乾燥SCを記述するモデル^{7、8、14、15、16}に半径方向の変位プロファイルを適合、E.がSCを想定弾性率を有する変形可能な弾性基質に付着厚さ、時間_SC、半径R、および弾性率、E _SCを 、時間変化のRディスクは、よく定義され、一定のポアソン比を有する_、νSC = 0.4 ^{7 、8。}最小二乗法を使用して最高のフィットを取得します。
   注：フィッティングのために使用されたモデルが修正ベッセル関数の面で放射状の変位を説明します：
   （1）
   とともに 、 そして
   用語によって与えられる浸透深さに対応し、
   。
   基板の剛性パラメータです。有効サンプルサイズは、基板の厚さよりもはるかに大きい場合。ここでは、パラメータそしてそれぞれ基板厚ポアソン比を表します。シリコーンエラストマー基板¹⁷のポアソン比をν= 0.5です。
4. モデルパラメータは、半径方向の変位プロファイルに式（1）の最小二乗適合から、各時間ステップで、α、β得ます。
   1. 式を使用して、SC弾性率、E _SCを得るために、フィッティングパラメータβを採用し、
      
   2. 収縮乾燥STRE時間変化を得るために、フィッティングパラメータαを使用しますssは、PSC、式を使用して、
      

結果

図1（a）は、蛍光ビーズ（セクション3）で被覆されたSC試料の代表的な蛍光画像を示します。サンプルの対応する透過光像（b）はによりサンプルの円対称に25％RHで16時間乾燥した後に形成空間分解乾燥変位の矢印プロットを重ね1図に示されている、これらの変位は、方位角することができます平均しました。 図1（c）は、...

ディスカッション

この記事では、動的な乾燥挙動とヒトSCの機械的特性を測定するために使用することができる技術を説明します。以前の研究は、この技術は、環境条件、一般SC ^7,8の動的な乾燥挙動の化粧品洗浄剤及び保湿に使用される化学製品の効果を定量するために使用することができることを実証しました。プロトコルにおける重要なステップの数があります...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer base	Dow-Corning	1064291
Silicone elastomer Curing Agent	Dow-Corning	1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8803
FluoSpheres Carboxylate 1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8823
FluoSpheres Carboxylate 1 µm nile red fluorescent 535/575	Thermo Fisher	F8819
Trypsin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	T6567
Trypsin inhibitor type II-s	Sigma-Aldrich	T9128
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0294
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P7059
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	E7750
Vortexer mixer	VWR	58816-123
6mm diameter hole punch	Sigma-Aldrich	Z708860
SOLA 6-LCR-SB	Lummencor light engine	No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1x Objective	Nikon Plan UW	MRL00012
CFI Plan Fluor 40x Oil Objective 1.3 na - 0.20mm wd	Nikon Plan Fluor	MRH01401
Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon	MEA53200
Clara-E Camera	Andor	DR-328G-C02-SIL
Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design	Nikon	99888
Ti-S-E Motorized Stage	Nikon	MEC56110