Измерение и моделирование Сократительная Сушка в роговом слое кожи человека

Резюме

В данной статье описывается метод количественной оценки динамических характеристик сушки и механические свойства рогового слоя путем измерения с пространственным разрешением в плоскости сушки перемещения образцов ткани круговыми привязанных к эластомерной подложке. Этот метод может быть использован для измерения, как различные виды химической обработки изменяют высыхание и ткани механические свойства.

Аннотация

Роговой (SC) является наиболее поверхностный слой кожи. Его контакт с внешней средой означает, что этот слой ткани подвергается обоим очистительных средств и суточных колебаний в окружающей влажности; оба из которых могут изменить содержание воды в ткани. Снижение содержания воды от тяжелой барьерной дисфункции или низкой влажности может изменять жесткость SC и вызвать накопление сушильных напряжений. В экстремальных условиях, эти факторы могут привести к механическому разрыву ткани. Мы создали метод с высокой пропускной способностью количественной оценки динамических изменений в механических свойствах SC при сушке. Этот метод может быть использован для количественной оценки изменений в поведении сушки и механические свойства SC с косметическим моющим средством и увлажняющее средство лечения. Это достигается путем измерения динамических изменений в пространственно решенных плоскостных сушильных перемещений образцов круговых тканей, прилипших к эластомерным субстратом. В плоскости радиальных перемещений ПОЛУЧuired во время сушки азимутально усредненные и оснащены профилем на основе линейной упругой модели сократимости. Динамические изменения в сушильном стресса и SC модуля упругости можно извлечь из профилей подобранной модели.

Введение

Наружный самый слой эпидермиса, или роговой слой (SC) , состоит из липких клеток корнеоцитов , окруженных богатой липидами матрицей ^{1, 2.} Состав и структурная целостность СК имеет важное значение для поддержания правильного функционирования барьера ^3, который предотвращает вторжение от микроорганизмов и противостоит как механические силы и чрезмерную потерю воды ^4. Способность продуктов личной гигиены для поддержания или ухудшать функцию барьера кожи представляет большой интерес для кожи здравоохранения и косметической промышленности ^5. Ежедневное применение средств личной гигиены , как известно, изменяют механические свойства SC ^{6, 7, 8.} Например, поверхностно-активные вещества, содержащиеся в косметических моющих средств может привести к значительному увеличению модуля упругости и наращиваниесушильные напряжения в СК, увеличение склонности ткани к треснуть ^{7, 9.} Глицерин содержится почти во всех косметических увлажняющих средств может смягчить SC и уменьшить накопление сушильных напряжений ^{8, 10, 11,} уменьшая вероятность разрыва ткани.

Подробно описано в данной статье метод позволяет количественной оценки динамических характеристик сушки и механические свойства SC сушки в контролируемых средах ^{7, 8.} Ранее эта техника была продемонстрирована быть способным выяснении влияния различных косметических продуктов на изменения в динамическом режиме сушки и механические свойства SC ткани. Это достигается с помощью количественного анализа сушильно-индуцированной усадки ткани SC человека приклеена к подложке из мягкого эластомера, подгонка сушильных смещениях с простымсократимость модель, а затем извлечения модуля упругости и сушки напряжение от подогнанной профиля. Когда требуется тестирование нескольких образцов SC, этот способ предлагает более быстрый альтернативой одноосного тензометрии, использует значительно меньше тканей и обеспечивает более физиологически соответствующую сушку путем предотвращения испарения с образца нижней стороны.

протокол

Освобожденные утверждение (3002-13) для проведения исследований с использованием образцов обезличенной ткани в соответствии с Департаментом здравоохранения и социальных служб США правила, 45 CFR 46,101 (б) (4) была удовлетворена. Полная толщина кожи получена от плановой операции. В этой статье источник ткани 66-летний кавказских женской груди.

1. Получение Эластомер с нанесенным покровные

1. В стеклянную пробирку емкостью 20 мл, смесь 0,107 г Sylgard 184 отвердителем с 5.893 г основания. Общая масса смеси составляет 6 г основанием с отверждением отношение агента в 55: 1.
2. После смешивания стеклянной палочкой для обеспечения однородности, поместите флакон стекла в вакуумной камере и Дега, чтобы удалить все пузырьки.
3. Поместите стеклянную крышку скольжения (55 мм х 25 мм) в центре спин для нанесения покрытий. Добавить ~ 1 мл смеси на центр крышки скольжения. Используйте 5000 мкл пипетки с конца отрезать ножницами. Спин пальто покрытие скольжению при 2000 оборотах в минуту в течение 60 сек.
   1. Повторите этот рrocess для создания 5-6 субстратов.
4. Лечение Сокрытие промахов в печи в течение 12 ч при температуре 60 ° C.
5. Используйте лезвие, чтобы частично удалить эластомерной пленки из жертвенного подложки. Используйте несмываемый маркер, чтобы отметить Topside эластомерного пленки и облученной стекла.
6. Установите образец на инвертированный микроскоп и использовать удаленный фокус аксессуар для записи разницу в г высоты между координационными плоскостями двух марок. Это соответствует толщине эластомера подложки, ч.

2. Получение рогового слоя

1. С помощью водяной бани или подогретой мешалка для нагревания стеклянный стакан, наполовину заполненный деионизованной водой (DW) до 60 ° C. Внутри бокса биологической безопасности, погрузить всю толщину кожи человека в воде в течение 4 мин.
2. Немедленно перенести образец кожи в химический стакан, содержащий DW охлаждают до <10 ° С в течение 4 мин. Половина наполнения стакана минимизирует разбрызгивание биологически опасными материалами,
3. Удалить кожу из стакана, место в чашке Петри, и аккуратно изолировать эпидермис с помощью пары изогнутых пинцетов обнюханными ткани.
4. Поместите изолированном эпидермисе базальной стороной вниз в чашку Петри выложены марлю. Убедитесь, что базальный слой полностью контактирует с марлей.
   1. Замачивание марлю в 0,25% (вес / объем) типа IX-S поджелудочной железы свиньи раствора трипсина, растворенного в 0,1 М фосфатном буферном солевом растворе в течение 6-8 ч при комнатной температуре. Добавьте только достаточное количество трипсина в контейнере, чтобы смочить марлю.
5. Поднимите марлю с помощью пинцета ткани и плавать его в контейнере, частично заполненной DW. Осторожно потяните SC, чтобы отделить его от марли.
6. Вымойте рогового слоя 3-4 раза в DW для удаления остаточного эпидермальный ткань, которая остается прикрепленной к SC.
7. Поплавок обособленное SC в растворе 0,4% глицин макс (соя) ингибитор трипсина в DW. Используйте планшетном шейкере для перемешивания ткани в течение 10 мин.
8. Поплавок SC в чашке Петри частичнозаполнена DW. Используйте планшетном шейкере для перемешивания ткани в течение 10 мин.
9. Сушат изолированный SC лист на ультра-тонкой пластиковой сетки в течение 48 часов при комнатной температуре (25 ° C, 40% относительной влажности (RH)).
10. Отделить SC от сетки и вырезать отдельные образцы круговой радиус R = 3 мм, используя круглую дырокола. Отметьте центр наиболее удаленном от центра лица с небольшим спиральным метки с использованием несмываемым маркером. Это обеспечивает визуальный сигнал для распознавания TopSide КА.
    Примечание: Неизгладимое отметка должна быть применена в центре образца, где сушка деформации будет наименьшим. Это позволит свести к минимуму влияние маркера на записанных профилей сушки смещения.

3. Образец Лечение и Отложение

1. Перемешивайте образцы SC в течение 30 мин в 15 мл DW, содержащей 90 мкл флуоресцентный маркер бусин (505/515 нм, диаметр 1 мкм, карбоксилат-модифицированный). Эти отложения бусин на поверхность SC
   Примечание: В то время как осаждение лАРГЕ количество бисера на КА может незначительно медленной сушке относительно образцов без бусинок присутствуют ^12, он будет максимизировать пространственное разрешение полей деформации в плоскости , которые можно получить в дальнейшем. Поэтому выбор объема шарика добавлен должны быть сделаны специальные.
2. Удалить образцы SC и поместить их в чашку Петри, частично заполненном DW.
3. Частично погружать подложку в ДГ под небольшим углом 15-30 °.
4. Чтобы закрепить края образца плавающего SC на линии контакта между подложкой и интерфейсом воды. Вертикально снятия подложки из воды будет плавно ламинировать образец SC на подложку без складок и вовлеченного воздуха пузырьки.
5. Повторите шаг 3.4, чтобы разместить до 6 образцов SC на каждой подложке. Оставьте по крайней мере, зазор 2-3 мм между образцами и избежать образца ламинирование близко к краю подложки. Это предотвращает высыхание одного образца, влияющих на сушильных перемещений в другой.
6. Сухие смонтированные образцы SC в лабораторных условиях в течение 60 мин. Это позволяет остаточную воду между SC и субстратом для испарения и обеспечивает полную адгезию тканей.
   Примечание: На этом этапе образцы SC можно лечить с помощью химических или косметических составов ^{7, 8} путем размещения подложки вверх дном в желаемом раствором в течение необходимого периода времени. Повторите шаг 3,6 раз этап обработки выполняется. После сушки, неполное сцепление SC образцов с подложкой можно проверить с помощью микроскопии в проходящем свете. Захваченные пузырьки под образцом SC или расслаиваться края будет формировать четкие вариации контраста в образце с четко определенными краями.
7. Создание влажной камере путем размещения чашки Петри, частично заполненной жидкостью в герметично закрытом контейнере.
8. Место субстратов в камере в течение 24 ч до уравновешивания до относительной влажности 99%. Не ставьте подложки в Petrя блюдо.

4. Контроль окружающей среды микроскоп

1. Обеспечение контроля за состоянием окружающей среды через систему контроля влажности, подключенного к микроскопу монтируемый перфузионной камеры. Детали системы контроля влажности предоставляются на немецком языке и др. (2013) ⁷ и Лю и немецком языках (2015) ^8.
2. Устанавливать подложку на микроскопе, поместите перфузии камеры над подложкой и запечатать края перфузионной камеры с эластомером с помощью вакуумной смазки.
3. После того, как установлен, уравновешивания внутреннего воздуха до 99% RH до эксперимента. Это предотвращает испарение воды до эксперимента. После того, как изображения в разделах 5 или 7 началось, уменьшить внутреннюю влажность воздуха до требуемого значения.
   Примечание: В данной статье SC образцы высушивают до 25% относительной влажности

5. визуализации в самолет Сушильные перемещениях

1. Получение изображений образцов SC с использованием инвертированного microscoре с 1X объективом. Excite флуоресцентные шарики, используя легкий двигатель с FITC фильтром (503-530 нм излучение полосовой). Несколько образцов могут быть отображены последовательно во время сушки с использованием автоматизированного этап XY.
2. Запись флуоресцентные и прошедшего света изображения с помощью цифровой ПЗС-камерой с разрешением 1392 х 1040 пикселей. Поле зрения каждого изображения 8.98 х 6.71 мм, что позволяет единое изображение, чтобы захватить полный образец SC. Возьмем изображения с частотой 10 мин в течение 16 часов.

6. Подготовка основания для измерения толщины

1. В химическом вытяжном шкафу, поместите 1 мл силана (3-аминопропилтриэтоксисилан; ≥98%) в какой-то небольшой пластиковой крышкой. Поместите эластомерные субстраты из секции 1 и крышкой в ​​герметичном контейнере в течение 5 часов. Не допускать субстраты прийти непосредственно в контакт с силаном.
2. Добавить 5 мг EDC (N - (3-диметиламинопропил) - N -ethylcarbodiimide гидрохлорид; ≥99%) в 1,5 мл трубки. Добавить 500 мкл DW к EDC. Перемешивать раствор в течение 10 с с вихревым смесителем.
3. Добавить 0,076 г тетрабората натрия и 0,1 г борной кислоты в 20 мл DW. Смешать с помощью магнитной мешалки при 70 ° С (1 час). Добавить борную кислоту до тех пор, пока рН не является 7,4.
4. Добавьте 20 мл боратного буфера в 50 мл центрифужную пробирку. Добавить 60 мкл 1 мкм шариков (535/575 нм, карбоксилат-модифицированного) в буфер борат. Наконец, добавьте 200 мкл раствора EDC в бутылку. Встряхните пробирку, чтобы смешать шарик раствора, а затем вылить в 10 см диаметром чашки Петри.
5. Удалите силанизировать субстраты из контейнера и поместите их эластомер пленки стороной вниз в раствор гранулы. Делайте это медленно, чтобы предотвратить пузыри от попадания в ловушку. Две основы будет вписываться в каждой чашке Петри.
6. Оставьте субстраты, чтобы плавать в растворе шарик в течение 45 мин.
7. Используйте пинцет, чтобы удалить подложки из раствора шарик, затем промыть в DW для удаления несвязанных бусы.
8. Воздух сухой подложки. Продувка сжатым воздухом надповерхность эластомер пленка уменьшает образование пятен от воды.
9. Уплотнение субстратов в непрозрачном ящике, чтобы предотвратить фото-отбеливание гранул до осаждения SC образца.

7. визуализации Толщина SC

1. Образцы вкладов SC на подложку с использованием раздела 3. Однако выполнить шаг 3.1 без добавления флуоресцентных бусины в DW. Кроме того, наносить каплю 5 мкл неразбавленного раствора флуоресцентного маркера шарик (505/515 нм, диаметр 0,1 мкм) до поверхности каждого осажденного образца SC с пипеткой до выполнения шага 3.6.
2. Установить измерения толщины SC с помощью микроскопа с 40Х объективом. Измерить толщину образцов СУ с течением времени с использованием удаленного фокуса аксессуар для записи разности г высоты между двумя бортовыми фокальные плоскости слоя, расположенного на границе раздела SC-подложка, так и надводной части КА.
3. Измерить толщину 3 областей каждого образца SC в течение периода сушки 3 ч. ТолщинаSC образцов достигает установившегося значения в течение этого времени ^8.

8. Количественная и моделирование тканей Деформация

1. Использование частиц изображения велосиметрии ¹³ для получения пространственно решена в плоскости сушки смещения от флуоресцентных изображений на каждом шаге по времени записанного.
2. Использование MATLAB для получения азимутально усредненных радиальных и азимутального смещения профилей из поля смещений каждого радиально-симметричного образца SC.
   Примечание: Пример набора данных (под названием 'd.mat') и MATLAB код (под названием 'PIV-processing.m »), который выполняет как этот шаг и шаг 8.3 была представлена ​​в справочной информации.
3. Установить профили радиального смещения к модели ^{7, 8, 14, 15, 16} , описывающего сушки SC в качестве сокращающейся линейной упругой циркуляциейг диск времени различной толщины, H _SC, радиус R, и модуль упругости, E _SC, приклеенный к деформируемой упругой подложке с модулем упругости, Е. Предположим , SC имеет отношение четко определенной и постоянной Пуассона, ν _SC = 0,4 ^{7 , 8.} Получите лучшие припадки с использованием минимального подхода наименьших квадратов.
   Примечание: Модель, используемая для подгонки описывает радиальных перемещений в терминах модифицированных функций Бесселя являются:
   (1)
   с , а также
   Срок соответствует глубине проникновения заданной,
   .
   обозначает параметр субстрат жесткости; действительный, когда размеры выборки намного больше толщины подложки. Здесь параметры, а также соответственно обозначают толщину подложки коэффициент Пуассона. Коэффициент Пуассона эластомерного подложки ¹⁷ силикон ν = 0,5.
4. Получить параметры модели а и β на каждом временном шаге от наименьших квадратов уравнения (1) для радиального профиля смещения.
   1. Наймите фитинга параметр & beta ; получить SC модуль упругости, E _SC, используя выражение,
      
   2. Используйте подходящие параметр а для получения времени изменения сократительной сушки STREсс, PSC, используя выражение,
      

Результаты

На рисунке 1 (а) показывает характерный флуоресцентное изображение образца , покрытого SC флуоресцентных бусин (раздел 3). Соответствующий передаваемый свет изображение образца показана на рисунке 1 (б) , обложенных с колчаном участком пространственно ...

Обсуждение

В этой статье мы опишем метод, который может быть использован для измерения динамических характеристик сушки и механические свойства человеческого SC. Предыдущие исследования показали , что этот метод может быть использован для количественной оценки последствий условий окружающей ср...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer base	Dow-Corning	1064291
Silicone elastomer Curing Agent	Dow-Corning	1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8803
FluoSpheres Carboxylate 1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8823
FluoSpheres Carboxylate 1 µm nile red fluorescent 535/575	Thermo Fisher	F8819
Trypsin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	T6567
Trypsin inhibitor type II-s	Sigma-Aldrich	T9128
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0294
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P7059
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	E7750
Vortexer mixer	VWR	58816-123
6mm diameter hole punch	Sigma-Aldrich	Z708860
SOLA 6-LCR-SB	Lummencor light engine	No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1x Objective	Nikon Plan UW	MRL00012
CFI Plan Fluor 40x Oil Objective 1.3 na - 0.20mm wd	Nikon Plan Fluor	MRH01401
Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon	MEA53200
Clara-E Camera	Andor	DR-328G-C02-SIL
Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design	Nikon	99888
Ti-S-E Motorized Stage	Nikon	MEC56110