فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Summary

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- ³² P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

Abstract

البروتينات كيناسس هي قادرة على التحكم في التغيرات الخلوية واسعة النطاق ردا على صفيفات معقدة من المحفزات، وقد وجه الكثير من الجهد للكشف عن تفاصيل مؤكدة لتنظيمها. وتشتمل كيناسيس على شبكات تشوير تكون عيوبها في كثير من الأحيان سمات لأشكال متعددة من السرطان والأمراض ذات الصلة، مما يجعل من منصة فحص قابلة للتلاعب في العوامل التنظيمية المنبع والتحقق من متطلبات رد الفعل الحرجة في البحث عن العلاجات المحسنة. هنا، نحن تصف مقايسة كيناز الأساسية التي يمكن تكييفها بسهولة لتتناسب مع أسئلة تجريبية محددة بما في ذلك ولكن لا تقتصر على اختبار آثار العوامل البيوكيميائية والدوائية، والتلاعب الجيني مثل الطفرة والحذف، وكذلك ظروف زراعة الخلايا والعلاجات للتحقيق آليات تشوير الخلية. هذا الاختبار يستخدم راديولبلد [γ- ³² P] أتب، والذي يسمح للمقارنات الكمية وتصور واضح من النتائج، ويمكن أن يكون وزارة الدفاعإفيد للاستخدام مع إمونوبريسيبيتاتد أو كيناز المؤتلف، ركائز محددة أو مكتوبة، في جميع أنحاء مجموعة واسعة من ظروف التفاعل.

Introduction

بروتينات كيناز هي إنزيمات متطورة حرجة لنقل الإشارات الخلوية إلى ردود مناسبة ¹ . ونظرا لأدوارهم في الحفاظ على التوازن والوقاية أو تعزيز حالات المرض ² ، وأساليب الكيمياء الحيوية لتقييم نشاط كيناز لا تزال أدوات قوية لتحديد معالم الإشارات حقيقية النواة ³ . على الرغم من أن استراتيجيات استخدام الأجسام المضادة الفوسفو محددة كانت مفيدة للغاية من حيث قياس آثار ظروف العلاج المختلفة على حالة الخلية إشارة ⁴ ، فحص كيناز يسمح لقياس آثار ظروف العلاج المختلفة مباشرة من حيث النشاط الأنزيمي من كيناز من فائدة. في حين أن هناك العديد من الخيارات لفحوصات مماثلة التي لا تستخدم المواد المشعة ⁵ ، ونحن لا نزال نعتمد على هذه الطريقة لكمية قوية من النتائج. هناكهي اثنين من التطبيقات النموذجية لهذا الفحص، على حد سواء قيمة لأسباب مختلفة: إمونوبريسيبيتاتد (إب) فحص كيناز ( الشكل 1 ) وفحص البروتين كيناز المؤتلف ( الشكل 2 ).

مقايسة كيناز إب مفيدة بشكل كبير لتحديد العوامل القادرة على تفعيل كينازات بروتين معينة وكذلك قياس ظروف العلاج المثبطة. وباختصار، يتم نقل كيناز الممزوجة حاتمة من الفائدة إلى خلايا حقيقية النواة مثقف، يتعرض لمجموعة متنوعة من العلاجات، إمونوبريسيبيتاتد، ومعاير للقدرة على دمج الفوسفات راديولبلد في ركيزة نموذج (على سبيل المثال الميالين البروتين الأساسي (مب)). ويمكن أيضا إجراء فحص كيناز إب دون اللجوء إلى أوفيركسريسيون، إما عن طريق إمونوبريسيانتاتيون من البروتين الذاتية أو أي عدد من تقنيات تحرير الجينوم. لأن العلاجات تدار في الثقافة، وهذا الأسلوب يمكن الكشف عن التحفيز تنتقل من خلال عوامل متعددة المنبعأو مسارات موازية من خلال قراءة في المختبر . ميزة رئيسية واحدة من هذا الأسلوب هو أنه لا يتطلب معرفة مسبقة من العوامل المباشرة المنبع أو المصب أو مواقع الفسفرة فيه. وعلاوة على ذلك، مرة واحدة وقد تم تحديد ركائز محددة لكيناز من الفائدة، ويمكن استخدام نفس بروتوكول فحص كيناز مع مكونات المؤتلف لقياس نشاط معين نحو ركائز الطبيعية وتحديد مواقع فسفرة معينة عندما يقترن تحليل الطيف الكتلي. المواقع التي تم التعرف عليها بهذه الطريقة يمكن التحقق من صحة مزيد من المقايسات مع كيناز استخدام المسوخ الركيزة. وأخيرا، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للكشف وقياس أوتوفوسفوريلاتيون.

بروتوكول المقدمة هنا يفترض إما مخطط تنقية البروتين الأمثل أو طريقة ترنسفكأيشن للتعبير عن كيناز تقارب الموسومة من الفائدة في الخلايا المستزرعة. لمعارض أكثر تفصيلا من ترنسفكأيشن، تحلل، إمونوبرسيبيتاتيون، والبروتين بروتين تنقيةأوكولس، نقترح الإشارة إلى البروتوكولات كولد سبرينغ هاربور ⁶ . لمزيد من المعلومات حول تطوير مقايسة وتعديل، يرجى الرجوع إلى البروتين الفسفرة: طرق مختارة في الإنزيمية ⁷ .

Protocol

1. كيناز تنقية الموارد و إمونوبريسيبيتاتيون خط أنابيب

ملاحظة: كيناسيس للاستخدام مع هذا الفحص قد تكون مصدرها إمونوبريسيبيتاتس من الخلايا المستزرعة أو وسائل المؤتلف مثل تنقية تقارب الموسومة ⁶ . وفيما يلي بروتوكول عام للعلم الموسومة مناعي التي قد تضطر إلى تعديل اعتمادا على كيناز الفائدة. يجب حفظ كل شيء على الجليد عند الإمكان.

1. إضافة 2 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الأجسام المضادة إلى 200 ميكرولتر من ليسيتس الخلية (عادة ~ 1 ملغ / مل تركيز البروتين الكلي) واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة بينما هزاز.
2. غسل البروتين وحبات سيفاروس 2-3 مرات مع العازلة تحلل (انظر أدناه) عن طريق الغزل لفترة وجيزة في 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة في 5000 x ج ("تدور اللمس")، وإزالة طاف مع ماصة، وإعادة تعليق الخرز في المخزن المؤقت .
   1. إعداد تحلل العازلة: 50 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 7.7، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي مغكل ₂، 1 ملي إغتا، 10٪ الجلسرين، 0.2 ملي أورثوفاناديت الصوديوم، 100 ملي فلوريد الصوديوم، 50 ملي β- غليسيروفوسفهات، 0.1٪ تريتون X 100 أو 0.1٪ نب-40.
3. إضافة 30 ميكرولتر من الطين 50٪ من البروتين A الخرز سيفاروس في تحلل العازلة إلى ليسيتس؛ احتضان في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة بينما هزاز.
4. لمس تدور في 4 درجات مئوية لبيليه الخرز وإزالة طاف.
5. غسل 3 مرات مع 1 مل من حبة غسل العازلة (1 M كلوريد الصوديوم، 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4).
6. يغسل مرة واحدة مع 1X كيناز رد فعل العازلة (10 ملي هيبيس درجة الحموضة 8.0، 10 ملي مغكل ₂ ). إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت دون إزالة الخرز.

2. إنيتياليزينغ كيناس ردود الفعل

ملاحظة: لفحوصات كيناز إب، ~ 15 ميكرولتر من الخرز غير معلق هو نموذج البداية نموذجية. بالنسبة لفحوصات كيناز البروتين المؤتلف، تتراوح كميات البداية النموذجية من 0.1-1.0 ميكروغرام في 1-10 لأحجام التفاعل النهائية 25-50 ميكرولتر. ضبط وحدات التخزين من عينة البروتين المؤتلفs لتكون متساوية مع المخزن المؤقت يتم تخزينها في قبل تهيئة الفحص. عند استخدام كميات عالية من كيناز، وتشمل بروتين الناقل مثل بسا للمساعدة في الحفاظ على استقرار البروتين لمدة الفحص.

1. إعداد 5X كيناز رد فعل العازلة الواردة أدناه:
   50 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 8.0
   50 ملي مغكل ₂
   50 ملي بنزاميدين (مثبط البروتياز)
   50 ملي دت (عامل تخفيض)
   250 ميكرومتر أتب (غير المسماة، أو "الباردة")
2. الحفاظ على عينات كيناز على الجليد في أنابيب 1.5 مل. إعداد خليط التفاعل التالي في منفصلة، ​​المبردة 1.5 مل أنابيب:
   21 ميكرولتر H ₂ O
   6 ميكرولتر 5X كيناز رد فعل العازلة
   1 ميكرولتر راديولبلد ("الساخنة") أتب
   2 الركيزة ميكرولتر (~ 5 ملغ / مل)
   ملاحظة: لفحوصات كيناز المؤتلف، قد يتم تعديل حجم لاستيعاب البروتين المنقى. حساب مثل هذا الحجم التفاعلي النهائي هو 30 ميكرولتر. استخدام هذه الوصفة لإعداد سيدمزج. عند استلام أتب المسمى، مخفف الأسهم في H ₂ O إلى نشاط محدد من 0.01 ميسي / ميكرولتر قبل إضافة إلى خليط التفاعل.
3. لتهيئة الفحص، إضافة خليط التفاعل الكامل إلى عينة كيناز واحتضان رد فعل في 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى 1 ساعة اعتمادا على نشاط كيناز يجري مقايسة.
   ملاحظة: عند العمل مع كيناز الذي لم يتم تقييم نشاط سابقا، إجراء دورة الوقت من النشاط كيناز مع فترات 5 دقائق بين نقاط الوقت.

3. رد الفعل إنهاء و سدز-بادج

1. وقف رد فعل من خلال وضع على الجليد وإضافة 7.5 ميكرولتر 5X العازلة عينة ليملي ⁶ .
2. الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى 2 دقيقة في كتلة الحرارة.
3. اللمس تدور وتحميل 20 ميكرولتر لكل بئر على 10-15٪ سدز-بادج هلام. تشغيل هلام طويلة بما فيه الكفاية لفصل كيناز والركيزة (عادة 1 ساعة في قوة ثابتة من 5 W) تأكد من الحفاظ على جهاز هلام محمية للحد من التعرض ل ³² P.
   1. هنا، استخدام أجهزة هلام محلية الصنع، ولكن القياسية المتاحة تجاريا مصغرة هلام هي مناسبة تماما. استخدم الأبعاد كما يلي:
      المواد الهلامية: 8 سم العرض، 5.5 سم طول (حل)، سمك 1.5 مم.
      أمشاط: 15 بئرا، سمك 1.5 مم، عرض 2.9 مم، عمق 16 ملم

4. جل تلطيخ والتجفيف

تنبیھ: یجب أن تکون جمیع الخطوات مؤکدة للحد من التعرض الشخصي ل ³² P باستخدام التدریع المشع وارتداء معدات الوقایة الشخصیة. لمزيد من المعلومات حول خطوات محددة يتم تضمين بعض المراجع المفيدة.

1. إزالة هلام من الزجاج / الألومينا لوحات ومكان في 50 مل كوماسي وصمة عار (10٪ حمض الخليك الجليدي، 50٪ الميثانول، 0.25٪ R-250 صبغ) لمدة 1 ساعة على شاكر المداري تعيين إلى 50 دورة في الدقيقة. لهذه الخطوة استخدام حاوية أكبر قليلا من هلام نفسها. ⁸
2. نقل هلام من وصمة عار لإصلاح الحل (10٪ جلي الخليك أسيد، 20٪ الميثانول) من أجل إزالة وصمة عار. روك الهلام في 600-700 مل من حل تحديد بين عشية وضحاها على شاكر المداري في 50 دورة في الدقيقة. مكان قطع من رغوة أو معقود مناديل مختبر في الحاوية مع هلام لامتصاص صبغ كوماسي ^{8 ، 9} .
3. إزالة هلام من تحديد الحل ونقع في 200 مل الميثانول لمدة 1-2 دقيقة مع التحريض لطيف حتى هلام يتحول الأبيض حليبي. وهذا سوف يساعد على منع تكسير خلال خطوة التجفيف.
4. الرطب 14 سم × 14 سم قطعة من ورقة مرشح النوعي مع الميثانول ومكان على بلاطة هلام فراغ بلاطة. وضع هلام أسفل على الجانب الأمامي ورقة مرشح مواجهة.
5. تغطية هلام مع التفاف البلاستيك بعناية لتجنب التجاعيد والهواء فقاعات. تشغيل مجفف لمدة 1.5 ساعة عند 80 درجة مئوية. بعد أن تم تحقيق الفراغ فتح الغطاء ولف أي فقاعات الهواء إذا لزم الأمر مع لينة المطاط المطاط.

5. أوتوراديوغرام والتلألؤ التهم

1. إزالة دريهلام إد وإرفاق علامة أوتوراد، حاكم الفسفورية أو النقاط إلى ورقة الترشيح على جانب هلام. إذا كنت تستخدم النقاط تأكد من أنها في نمط غير المتماثلة. هذا سوف محاذاة هلام مع الفيلم بعد التعرض والتنمية.
2. استخدام عداد جيجر للتحقق من شدة الإشارة. لتعرض الإشارات الأضعف في -70 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية مع شاشة تكثيف زيادة كثافة الفرقة الفيلم.
3. في غرفة مظلمة وضعت هلام المجففة في فيلم كاسيت مع فيلم وشاشة تكثيف في الترتيب التالي من أعلى إلى أسفل: هلام، فيلم، وتكثيف الشاشة.
4. إرفاق الشاشة المكثفة لغطاء الكاسيت والشريط هلام في مكان لجعل هذه الخطوة أسهل. تنبعث الشاشة المكثفة الضوء عندما تشعع جزيئات بيتا من ³² P. هذه الانبعاثات الخفيفة تخترق الفيلم أكثر كفاءة من جزيئات بيتا.
   1. تأكد من أن طول الموجة المنبعثة من تكثيف الشاشةالبرك إلى الطول الموجي الفيلم هو الأكثر حساسية ل.
   2. استخدام عداد جيجر لتحديد كم من الوقت لتترك التعرض ل: إذا كان عدد كيم ~ 100 أو أقل، حاول بين عشية وضحاها في -70 درجة مئوية. إذا العد هو ~ 10،000، تبدأ مع التعرض 1 ساعة وتحسين من هناك.
5. في ختام التعرض إزالة الفيلم وتطوير في المعالج الطبي / الأشعة السينية فيلم. إذا تم إجراء التعرض في -70 إلى -80 درجة مئوية، إما السماح كاسيت لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة لتقليل التكثيف على الفيلم أو إزالة الفيلم مباشرة قبل التكثيف أشكال ¹⁰ .
6. وضع الفيلم على ورقة هلام / مرشح المجففة ومحاذاة صورة علامة / النقاط مع علامات / النقاط على هلام المجففة. علامة على الفيلم العصابات المقابلة لمعايير البروتين. تسمية معايير البروتين والتي يمر ردود الفعل هي للرجوع إليها في المستقبل.
7. استئصال العصابات من هلام التي تتوافق مع فرق من الفائدة على الفيلم ووضعهافي 7 مل قوارير التلألؤ. إضافة 4 مل من سائل التلألؤ والعد مع عداد التلألؤ السائل. تأكد من ضبط العداد لمراقبة نافذة طيف الطاقة الصحيحة ل ³² ص.
   ملاحظة: تأكد من أيضا مكوس الفرقة المقابلة للركيزة من حارة التحكم لا كيناز. سيتم استخدام هذا لحساب الإشعاع الخلفية التي سيتم طرحها من جميع التهم التلألؤ عينة.

6. تحليل النتائج

ملاحظة: يوفر أوتوراديوغرام التصور النوعي للنتائج. ولقياس الكميات الدقيقة، يمكن قياس التضمين ³² P بواسطة عداد التلألؤ. يتم التعبير عن البيانات عادة من حيث النشاط النسبي، كما هو مبين في الشكل 1B . وطالما تم الحفاظ على ظروف موحدة لجميع العينات، والقياسات النسبية لنشاط معين كافية لمقارنة العلاجات.

1. عند حساب قيم النشاط المحدد المطلق، قم بإجراء الدقةأوس الأمثل لجميع ظروف التفاعل، بما في ذلك كيناز، الركيزة، وتركيزات أتب الباردة، من أجل ضمان نطاق خطي من النشاط على مدى دورة الزمن (على سبيل المثال 2 × [كيناز] = 2 × نشاط معين). ل كيناسيس مع نشاط معين عالية، إجراء المقايسات مع زيادة تركيز الركيزة في حالة النشاط كيناز محدودة بمقدار الركيزة.
2. حساب النشاط المحدد للكيناز من الفائدة في وحدات من نانوموليز الفوسفات نقلها في الدقيقة لكل كيناز ملغ.
   1. اطرح الفراغات من التكلفة لكل ألف ظهور في النطاقات المحسوبة.
   2. احسب تسوس أتب الساخن: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0.95 حيث t هو عدد الأيام منذ تاريخ المرجعية (يجب أن يوفرها البائع)، t _1/2 هو نصف عمر ³² P، وهو 14.3 يوما، و 0.95 يعكس كفاءة عداد التلألؤ. مثال: إذا كان استخدام أتب الساخن الذي هو 28 يوما من العمر، يجب أن تكون قيمة الاضمحلال 0.245.
   3. احسب(بمول) من مجموع أتب في الفحص (عادة هذا يساوي كمية أتب الباردة في رد الفعل): حجم الفحص (ميكرولتر) × [أتب الباردة] (ميكرومتر) = إجمالي أتب (بمولس). مثال: 30 ميكرولتر × 50 ميكرومتر = 1500 بمول
   4. حساب كيم / بمول أتب: [ميكرولتر من أتب الساخنة × (2.2 × 10 ⁷ ) عامل تسوس] / بمول من أتب الباردة.
      ملاحظة: قيمة 2.2 × 10 ⁷ تحويل 0.01 مسي / ميكرولتر من أتب إلى كيم.
   5. حساب كمية كيناز في الفحص في ملغ. لكل من كيناز المؤتلف و كيناسس إمونوبريسيبيتاتد، أساليب قياسية مثل المقايسات بكا هي مناسبة لتحديد تركيزات البداية. مثال: wtERK2 0.0002 ميكروغرام / ميكرولتر في رد فعل كيناز 50 ميكرولتر هو 0.01 ميكروغرام، أو 1 × 10 ^-5 ملغ.
   6. حساب إجمالي التكلفة لكل ألف ظهور في الفحص. تجميع 30 ميكرولتر ردود الفعل وتشغيل 20 ميكرولتر من كل رد فعل على هلام. ضرب عد في الدقيقة (بعد الطرح فارغة) من خلال عامل من إجمالي حجم الفحص / حجم تحميلها. الاستمرار في ما سبقعلى سبيل المثال، ضرب كل التهم بمقدار 1.5، أو 30/20.
   7. حساب النشاط المحدد من كيناز أكيد:
      مجموع كيم في مقايسة) / (كيم / بمول أتب) / (فحص الوقت بالدقائق) / (كمية كيناز في ملغ)
      ملاحظة: تقسيم القيمة أعلاه بنسبة 1،000 ينتج النشاط المحدد في نانوموليز / دقيقة / ملغ
3. حساب عدد مولز الفوسفات تدرج في الركيزة (طالما وزنه الجزيئي هو معروف). ويستخدم هذا لتحديد عدد الفوسفوسايت على بروتين معين مرة واحدة وقد ذهب رد الفعل إلى الانتهاء.
   إجمالي قيمة النقرة في الفحص) / (كيم / بمول أتب)] / (كمية الركيزة في بمولس)

النتائج

WNK1 إب المقايسات كيناز

تم ترانزفكتد ميك الموسومة WNK1 إلى خلايا HEK293 و إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة لمكافحة ميك ¹¹ . و إيمونوبريسيبيتات عرض نشاط كيناز نحو الركيزة نموذج مب وكذلك ?...

Discussion

كيناسس هي عائلة متنوعة من البروتينات التي تطورت وظائف واسعة في سياقات عديدة، وكانت مقايسات كيناز مفيدة بشكل لا يصدق في دراسة عدة بروتينات التشوير وساهمت بشكل كبير في فهمنا الحالي للاتصالات الخلوية. ومن الجدير بالذكر أن نفس المقايسة الأساسية استخدمت في تمييز كينازي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500