Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Resumen

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- ³² P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Resumen

Las proteínas quinasas son capaces de gobernar a gran escala los cambios celulares en respuesta a complejas matrices de estímulos, y mucho esfuerzo se ha dirigido a descubrir los detalles alostéricos de su regulación. Las quinasas comprenden redes de señalización cuyos defectos son a menudo características de múltiples formas de cáncer y enfermedades relacionadas, haciendo que una plataforma de ensayo sea susceptible de manipulación de factores reguladores aguas arriba y validación de requerimientos de reacción críticos en la búsqueda de terapias mejoradas. Aquí, describimos un ensayo de quinasa básico que se puede adaptar fácilmente para adaptarse a preguntas experimentales específicas incluyendo, pero sin limitarse a, ensayar los efectos de agentes bioquímicos y farmacológicos, manipulaciones genéticas tales como mutación y deleción, así como condiciones de cultivo celular y tratamientos para investigar Mecanismos de señalización celular. Este ensayo utiliza [γ-32P] ATP radiomarcado, que permite comparaciones cuantitativas y visualización clara de los resultados, y puede ser modPara uso con quinasa inmunoprecipitada o recombinante, sustratos específicos o tipificados, en una amplia gama de condiciones de reacción.

Introducción

Las proteínas quinasas son sofisticadas enzimas críticas para la transmisión de señales celulares en respuestas apropiadas ¹ . Dado su papel en el mantenimiento de la homeostasis y la prevención o promoción de estados de enfermedad [ ^2] , los métodos bioquímicos para evaluar la actividad quinasa siguen siendo herramientas poderosas para delinear los detalles de la señalización eucariótica [ ^3] . Aunque las estrategias que utilizan anticuerpos fosfo-específicos han sido altamente informativas en términos de medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento en el estado de señalización celular ⁴ , un ensayo de quinasa permite medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento directamente en términos de la actividad enzimática de una quinasa de interesar. Si bien existen varias opciones para ensayos similares que no utilizan materiales radiactivos ⁵ , seguimos dependiendo de este método para una cuantificación robusta de los resultados. AhíSon dos aplicaciones típicas de este ensayo, ambas valiosas por diferentes razones: el ensayo de quinasa inmunoprecipitada (IP) ( Figura 1 ) y el ensayo de proteína quinasa recombinante ( Figura 2 ).

El ensayo de IP quinasa es tremendamente útil para identificar factores capaces de activar proteínas quinasas específicas así como para calibrar condiciones de tratamiento inhibidor. Brevemente, se transfecta una cinasa marcada con epítopo de interés en células eucariotas cultivadas, se somete a una variedad de tratamientos, se inmunoprecipita y se determina la capacidad para incorporar fosfato radiomarcado en un sustrato modelo ( por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP)). IP kinasa también se puede realizar sin recurrir a la sobreexpresión, ya sea por inmunoprecipitación de proteínas endógenas o cualquier número de técnicas de edición del genoma. Debido a que los tratamientos se administran en cultivo, este método puede detectar estimulaciones transmitidas a través de múltiples factores ascendentesO vías paralelas por lectura in vitro . Una ventaja importante de este método es que no requiere conocimiento previo de factores directos de aguas arriba o aguas abajo o sitios de fosforilación en el mismo. Además, una vez que se han identificado sustratos específicos para una quinasa de interés, se puede usar el mismo protocolo de ensayo de quinasa con componentes recombinantes para medir actividad específica hacia sustratos naturales e identificar sitios específicos de fosforilación cuando se combinan con análisis de espectrometría de masas. Los sitios identificados de esta manera pueden validarse adicionalmente con ensayos de quinasa utilizando sustratos de sustrato. Por último, este método también puede usarse para detectar y medir la autofosforilación.

El protocolo proporcionado aquí asume un esquema de purificación de proteínas optimizado o un método de transfección para expresar una quinasa marcada por afinidad de interés en células cultivadas. Para exposiciones más detalladas de transfección, lisis, inmunoprecipitación y protOcols, sugerimos referirse a Cold Spring Harbor Protocolos ⁶ . Para obtener más información sobre el desarrollo del ensayo y la modificación, consulte la Fosforilación de Proteínas: Selected Methods in Enzymology ⁷ .

Protocolo

1. Recursos de purificación de quinasa y tubería general de inmunoprecipitación

NOTA: Las quinasas para uso con este ensayo pueden obtenerse a partir de inmunoprecipitados de células cultivadas o por medios recombinantes tales como la purificación marcada por afinidad ⁶ . A continuación se muestra un protocolo general para la inmunoprecipitación marcada con bandera que puede tener que ser modificada dependiendo de la quinasa de interés. Todo debe mantenerse en hielo cuando sea posible.

1. Añadir 2 μl de anticuerpo de 1 mg / ml a 200 μl de lisados ​​celulares (generalmente ~ 1 mg / ml de concentración de proteína total) e incubar a 4 ° C durante 1 h mientras se balancea.
2. Lavar las perlas de proteína Sepharose 2-3 veces con tampón de lisis (ver más abajo) girando brevemente a 4 ° C durante 30 s a 1 min a 5.000 xg ("spin"), retirando el sobrenadante con una pipeta y resuspendiendo las perlas en tampón .
   1. Preparar tampón de lisis: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glicerol al 10%, ortovanadato sódico 0,2 mM, fluoruro de sodio 100 mM, β-glicerofosfato 50 mM, Triton X 100 al 0,1% o NP-40 al 0,1%.
3. Añadir 30 μL de suspensión al 50% de perlas de sepharosa de proteína A en tampón de lisis a lisados; Incubar a 4 ° C durante 1 h mientras se mecían.
4. Toque el centrifugado a 4 ° C para sedimentar las perlas y eliminar el sobrenadante.
5. Lavar 3 veces con 1 mL de tampón de lavado de perlas (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4).
6. Lavar una vez con tampón de reacción 1x quinasa (HEPES 10 mM pH 8,0, MgCl2 10 mM). Retire la mayor cantidad posible de tampón sin retirar las perlas.

2. Inicialización de las reacciones quinasas

NOTA: Para los ensayos de quinasa IP, ~ 15 μl de perlas no suspendidas es una muestra inicial típica. Para los ensayos de proteína quinasa recombinante, las cantidades iniciales típicas oscilan entre 0,1 - 1,0 μg en 1-10 para 25-50 μL de volúmenes de reacción finales. Ajustar los volúmenes de la muestra de proteína recombinanteS sean iguales con el tampón en el que se almacenan antes de inicializar el ensayo. Cuando se usan altas cantidades de quinasa, incluyen una proteína portadora tal como BSA para ayudar a mantener la estabilidad de la proteína durante la duración del ensayo.

1. Preparar el tampón de reacción 5x quinasa dado a continuación:
   HEPES 50 mM pH 8,0
   MgCl $ ₂ $ 50 mM
   Benzamidina 50 mM (inhibidor de proteasa)
   50 mM DTT (agente de reducción)
   250 mu M ATP (sin marcar, o "frío")
2. Mantener las muestras de quinasa en hielo en tubos de 1,5 mL. Preparar la siguiente mezcla de reacción en tubos separados de 1,5 mL refrigerados:
   21 mu l de H _ { ₂ } O
   6 mu l de tampón de reacción 5x quinasa
   1 mu l de ATP radiomarcado ("caliente")
   2 μl de sustrato (~ 5 mg / ml)
   NOTA: Para ensayos de quinasa recombinante, el volumen puede ajustarse para acomodar la proteína purificada. Calcular de tal manera que el volumen de reacción final sea de 30 μl. Utilice esta receta para preparar un maestromezcla. Tras la recepción del ATP marcado, diluir el stock de H ₂ O a una actividad específica de 0,01 mCi / μl antes de añadir a la mezcla de reacción.
3. Para inicializar el ensayo, añadir toda la mezcla de reacción a la muestra de quinasa e incubar la reacción a 30 ° C durante 5 min a 1 h dependiendo de la actividad de la quinasa que se está analizando.
   NOTA: Cuando se trabaja con una quinasa cuya actividad no se ha ensayado previamente, realizar un curso de tiempo de actividad quinasa con intervalos de 5 minutos entre los puntos de tiempo.

3. Terminación de reacción y SDS-PAGE

1. Parar la reacción poniendo en hielo y añadiendo 7,5 μL de tampón de muestras Laemmli 5x ⁶ .
2. Calentar a 100 ° C durante 30 s a 2 min en bloque de calor.
3. Toque el centrifugado y cargue 20 μL por pocillo en gel SDS-PAGE al 10-15%. Haga funcionar el gel lo suficiente como para separar la quinasa y el sustrato (típicamente 1 h a una potencia constante de 5 W) Asegúrese de mantener el aparato de gel protegido para limitar la exposición a ³² P.
   1. Aquí, utilice aparatos de gel hechos en casa, pero los mini-geles estándar disponibles en el mercado son perfectamente adecuados. Utilice las dimensiones como sigue:
      Geles: 8 cm de ancho, 5,5 cm de longitud (resolución), 1,5 mm de espesor.
      Peines: 15 pozos, 1,5 mm de espesor, 2,9 mm de ancho, 16 mm de profundidad

4. Gel de tinción y secado

Precaución: Para todos los pasos, asegúrese de reducir la exposición personal a ³² P mediante el uso de blindaje radiactivo y el uso de equipo de protección personal. Para obtener más información sobre pasos específicos se incluyen algunas referencias útiles.

1. Se retira el gel de las placas de vidrio / alúmina y se coloca en 50 ml de tinción Coomassie (ácido acético glacial al 10%, metanol al 50%, colorante R-250 al 0,25%) durante 1 h en un agitador orbital ajustado a 50 rpm. Para este paso utilizar un recipiente que es ligeramente más grande que el propio gel. ⁸
2. Mueva el gel de la mancha a la solución de fijación (10% de acD, 20% de metanol) con el fin de des-manchar. Roca el gel en 600-700 mL de solución de fijación durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm. Colocar trozos de espuma o toallitas de laboratorio anudadas en el recipiente con el gel para absorber el colorante Coomassie ^{8 , 9} .
3. Quitar el gel de la solución de fijación y remojar en 200 ml de metanol durante 1-2 minutos con agitación suave hasta que el gel se vuelve blanco lechoso. Esto ayudará a evitar el agrietamiento durante la etapa de secado.
4. Humedezca una pieza de 14 cm x 14 cm de papel de filtro cualitativo con metanol y colóquela en un secador de vacío de gel de placas. Coloque el gel en el lado del papel de filtro hacia arriba.
5. Cubra el gel con envoltura de plástico con cuidado para evitar las arrugas y burbujas de aire. Hacer funcionar la secadora durante 1,5 ha 80 ° C. Una vez que se ha alcanzado el vacío, abra la tapa y despliegue cualquier burbuja de aire si es necesario con un rodillo de goma blanda.

5. Autoradiograma y Cuentas de Centelleo

1. EliminarEd y unir un marcador autorad, regla fosforescente o puntos al papel de filtro en el lado del gel. Si utiliza puntos asegúrese de que están en un patrón asimétrico. Esto alineará el gel con la película después de la exposición y el desarrollo.
2. Utilice un contador Geiger para comprobar la intensidad de la señal. Para señales más débiles, la exposición a -70 ° C a -80 ° C con una pantalla intensificadora aumentará la densidad de la banda de película.
3. En un cuarto oscuro, poner gel seco en un casete de película con película y una pantalla de intensificación en el siguiente orden de arriba a abajo: gel, película, pantalla intensificadora.
4. Conecte la pantalla intensificadora a la tapa del cassette y tape el gel en su lugar para facilitar este paso. La pantalla intensificadora emite luz cuando es irradiada por las partículas beta de los ³² P. Estas emisiones de luz penetran la película más eficientemente que las partículas beta.
   1. Asegúrese de que la longitud de onda emitida desde la pantalla intensificadora correspondaEstanques a una longitud de onda la película es la más sensible a.
   2. Utilice un contador Geiger para determinar cuánto tiempo dejará la exposición para: si el recuento de cpm es ~ 100 o inferior, intente durante la noche a -70 ° C. Si la cuenta es de ~ 10.000, comenzar con una exposición de 1 hora y optimizar desde allí.
5. Al final de la exposición quitar la película y se desarrollan en un médico / procesador de película de rayos X. Si la exposición se realizó entre -70 y -80 ° C, permita que el casete se caliente a temperatura ambiente para minimizar la condensación en la película o retirar la película inmediatamente antes de que las formas de condensación ¹⁰ .
6. Colocar la película sobre el gel / papel de filtro secado y alinear la imagen del marcador / puntos con los marcadores / puntos en el gel seco. Marque en la película las bandas correspondientes a las normas de proteínas. Etiquetar los estándares de proteínas y los carriles de las reacciones son para referencia futura.
7. Excise las bandas del gel que corresponden a las bandas de interés en la película y colocarlasEn 7 ml de viales de centelleo. Añadir 4 ml de líquido de centelleo y contar con contador de centelleo líquido. Confirme que el contador está configurado para supervisar la ventana de espectro de energía correcta para ³² P.
   NOTA: Asegúrese también de eliminar la banda correspondiente al sustrato del carril de control sin quinasa. Esto se usará para calcular la radiación de fondo que se restará de todos los recuentos de centelleo de la muestra.

6. Análisis de Resultados

NOTA: El autorradiograma proporciona una visualización cualitativa de los resultados. Para la cuantificación exacta, la incorporación de 32P se puede medir con un contador de centelleo. Los datos se expresan generalmente en términos de actividad relativa, como se muestra en la Figura 1B . Mientras se mantengan condiciones uniformes para todas las muestras, las mediciones relativas de la actividad específica son suficientes para comparar los tratamientos.

1. Al calcular los valores de actividad específicos absolutos, realice un rigorOptimización de todas las condiciones de reacción, incluyendo las concentraciones de quinasa, sustrato y ATP fría, con el fin de asegurar un rango lineal de actividad a lo largo del tiempo ( por ejemplo, 2 x [kinasa] = 2 x actividad específica). Para quinasas con alta actividad específica, realizar ensayos con una mayor concentración de sustrato en caso de que la actividad quinasa esté limitada por la cantidad de sustrato.
2. Calcular la actividad específica de la quinasa de interés en unidades de nanomoles de fosfato transferidos por minuto por mg de quinasa.
   1. Reste los espacios en blanco de las cpm en las bandas contadas.
   2. (T / t _1/2 )] x 0,95 donde t es el número de días desde la fecha de referencia (debe ser proporcionada por el proveedor), t _1/2 es el número de días desde la fecha de referencia Vida media de ³² P, que es 14,3 días, y 0,95 refleja la eficacia del contador de centelleo. Ejemplo: si se utiliza ATP caliente con 28 días de antigüedad, el valor de decaimiento debe ser 0.245.
   3. Calc(Pmol) de ATP total en el ensayo (usualmente esto es igual a la cantidad de ATP frío en la reacción): volumen de ensayo (μL) x [ATP frío] (μM) = ATP total (pmoles). Ejemplo: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
   4. Calcular cpm / pmol ATP: [μl de ATP caliente x (2,2 x 10 ⁷ ) x factor de desintegración] / pmol de ATP frío.
      NOTA: El valor de 2,2 x 10 ⁷ convierte 0,01 mCi / μl de ATP en cpm.
   5. Calcular la cantidad de quinasa en el ensayo en mg. Tanto para la quinasa recombinante como para las quinasas inmunoprecipitadas, los métodos estándar tales como los ensayos de BCA son adecuados para determinar las concentraciones de partida. Ejemplo: wtERK2 0.0002 μg / μL en una reacción de quinasa de 50 μl es 0,01 μg, o 1 x 10 ^-5 mg.
   6. Calcular el total de cpm en el ensayo. Reúna 30 μL de reacciones y corra 20 μL de cada reacción en un gel. Multiplicar las cpm contadas (después de la sustracción en blanco) por un factor del volumen total del ensayo / volumen cargado. Continuando con lo anteriorEjemplo, multiplique todos los conteos por 1,5 o 30/20.
   7. Calcular la actividad específica de la quinasa ensayada:
      Total cpm en el ensayo) / (cpm / pmol ATP) / (tiempo de ensayo en minutos) / (cantidad de quinasa en mg)
      NOTA: Dividiendo el valor anterior por 1.000 se obtiene la actividad específica en nanomoles / minuto / mg
3. Calcular cuántos mols de fosfato se incorporan en un sustrato (siempre y cuando se conozca su peso molecular). Esto se usa para determinar el número de fosfositos en una proteína particular una vez que la reacción ha terminado.
   Total cpm en el ensayo) / (cpm / pmol ATP)] / (cantidad de sustrato en pmoles)

Resultados

WNK1 IP quinasa ensayos

La WNK1 marcada con Myc se transfectó en células HEK293 y se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-Myc [ ^11] . El inmunoprecipitado mostró actividad quinasa hacia el sustrato modelo MBP así como hacia sí mismo ( Figura 1A ). WNK1 mutantes fueron luego probados para la actividad quinasa hacia MBP por el mismo método, esta vez empleando GST marcado construccio...

Discusión

Las quinasas son una familia diversa de proteínas que han desarrollado una amplia funcionalidad en numerosos contextos, y los ensayos de quinasa han sido increíblemente útiles en el estudio de varias proteínas de señalización y han contribuido en gran medida a nuestra comprensión actual de la comunicación celular. En particular, se utilizó el mismo ensayo básico para caracterizar dos cinasas dispares a pesar de diferencias importantes en estructura y actividad. WNK1 contiene una bolsa catalítica atípica dond...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500