Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Resumo

As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- ³² P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

Resumo

As cinases proteicas são capazes de governar mudanças celulares em grande escala em resposta a complexas matrizes de estímulos, e muito esforço tem sido direcionado para descobrir detalhes alostéricos de sua regulação. As quinases compreendem redes de sinalização cujos defeitos são frequentemente marcas de múltiplas formas de cancro e doenças relacionadas, tornando uma plataforma de análise passível de manipulação de factores reguladores a montante e validação de requisitos de reacção críticos na procura de terapêuticas melhoradas. Aqui, descrevemos um ensaio de quinase básico que pode ser facilmente adaptado para se adequar a questões experimentais específicas incluindo, mas não se limitando a, testar os efeitos de agentes bioquímicos e farmacológicos, manipulações genéticas tais como mutação e deleção, bem como condições de cultura de células e tratamentos para sondar Mecanismos de sinalização celular. Este ensaio utiliza [γ- ³² P] ATP radiomarcado, que permite comparações quantitativas e uma visualização clara dos resultados, e pode ser modSe para utilização com quinase imunoprecipitada ou recombinante, substratos específicos ou tipificados, numa vasta gama de condições de reacção.

Introdução

As cinases de proteínas são sofisticadas enzimas críticas para a transmissão de sinais celulares em respostas apropriadas ¹ . Dado o seu papel na manutenção da homeostase e na prevenção ou promoção de estados de doença ² , os métodos bioquímicos para avaliar a actividade de quinase continuam a ser ferramentas poderosas para delinear as particularidades da sinalização eucariótica ³ . Embora as estratégias que utilizam anticorpos fosfo específicos tenham sido altamente informativas em termos de medição dos efeitos de diferentes condições de tratamento no estado de sinalização celular ⁴ , um ensaio de cinase permite medir os efeitos de diferentes condições de tratamento directamente em termos da actividade enzimática de uma cinase de interesse. Embora existam várias opções para ensaios semelhantes que não utilizam materiais radioactivos ⁵ , continuamos a depender deste método para uma quantificação robusta dos resultados. LáSão duas aplicações típicas deste ensaio, ambas valiosas por razões diferentes: o ensaio de quinase imunoprecipitado (IP) ( Figura 1 ) e o ensaio de proteína quinase recombinante ( Figura 2 ).

O ensaio de quinase de IP é tremendamente útil para identificar factores capazes de activar cinases de proteína específicas, bem como avaliar as condições de tratamento inibitório. Resumidamente, uma quinase marcada com epítopo de interesse é transfectada em células eucarióticas cultivadas, submetida a uma variedade de tratamentos, imunoprecipitada e ensaiada quanto à capacidade de incorporar fosfato radiomarcado num substrato modelo ( por exemplo, proteína básica de mielina (MBP)). O ensaio de quinase de IP pode também ser realizado sem recorrer à sobre-expressão, quer por imunoprecipitação de proteína endógena ou qualquer número de técnicas de edição genómica. Uma vez que os tratamentos são administrados em cultura, este método pode detectar estimulações transmitidas através de múltiplos factores a montanteOu paralelas por leitura in vitro . Uma grande vantagem deste método é que não requer conhecimento prévio de factores directos a montante ou a jusante ou sítios de fosforilação. Além disso, uma vez identificados substratos específicos para uma quinase de interesse, o mesmo protocolo de ensaio de cinase pode ser utilizado com componentes recombinantes para medir actividade específica em relação a substratos naturais e identificar locais de fosforilação específicos quando combinados com análise de espectrometria de massa. Os locais identificados desta maneira podem ser ainda validados com ensaios de quinase utilizando mutantes de substrato. Por último, este método também pode ser utilizado para detectar e medir a autofosforilação.

O protocolo proporcionado aqui pressupõe um esquema de purificação de proteínas optimizado ou método de transfecção para expressar uma cinase marcada por afinidade de interesse em células cultivadas. Para exposições mais detalhadas de transfecção, lise, imunoprecipitação e protOcols, sugerimos referir-se a Cold Spring Harbor Protocolos ⁶ . Para obter mais informações sobre o desenvolvimento e modificação do ensaio, consulte a Fosforilação de Proteínas: Métodos Selecionados na Enzimologia ⁷ .

Protocolo

1. Kinase Recursos de Purificação e General Immunoprecipitation Pipeline

NOTA: As quinases para utilização com este ensaio podem ser obtidas a partir de imunoprecipitados de células cultivadas ou por meios recombinantes tais como a purificação marcada por afinidade ⁶ . Abaixo está um protocolo geral para a imunoprecipitação marcada por sinalização que pode ter de ser modificada dependendo da quinase de interesse. Tudo deve ser mantido em gelo quando possível.

1. Adicionar 2 μL de 1 mg / mL de anticorpo a 200 μL de lisados ​​celulares (geralmente ~ 1 mg / mL de concentração total de proteína) e incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balança.
2. Lavar as esferas de proteína Sepharose 2-3 vezes com tampão de lise (ver abaixo) por centrifugação breve a 4 ° C durante 30 s a 1 min a 5.000 xg ("spin toque"), remoção do sobrenadante com uma pipeta e resuspensão de esferas em tampão .
   1. Preparar tampão de lise: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10%, ortovanadato de s�io 0,2 mM, fluoreto de s�io 100 mM, p-glicerofosfato 50 mM, Triton X 100 a 0,1% ou NP-40 a 0,1%.
3. Adicionar 30 μL de pasta de 50% de pérolas de sepharose de proteína A em tampão de lise a lisados; Incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balançando.
4. Toque a centrifugação a 4 ° C para sedimentar as esferas e remova o sobrenadante.
5. Lavar 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem de pérolas (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4).
6. Lavar uma vez com tampão de reacção 1x quinase (HEPES 10 mM pH 8,0, MgCl ₂ 10 mM). Remova o máximo possível de tampão sem remover as contas.

2. Inicializando Reações de Quinase

NOTA: Para ensaios de cinase IP, ~ 15 μL de contas não suspensas é uma amostra inicial típica. Para ensaios de proteína quinase recombinante, as quantidades de partida típicas variam de 0,1-1,0 μg em 1-10 para 25-50 μL de volumes de reacção final. Ajustar os volumes da amostra de proteína recombinanteS para serem iguais com o tampão que são armazenados antes da inicialização do ensaio. Quando se utilizam quantidades elevadas de quinase, incluir uma proteína transportadora tal como BSA para auxiliar na manutenção da estabilidade da proteína durante a duração do ensaio.

1. Preparar o tampão de reacção quinase 5x indicado abaixo:
   HEPES 50 mM pH 8,0
   MgCl2 50 mM
   50 mM de Benzamidina (inibidor de protease)
   DTT 50 mM (agente de redução)
   250 μM de ATP (não marcado, ou "frio")
2. Manter amostras de cinase em gelo em tubos de 1,5 mL. Preparar a seguinte mistura reaccional em tubos separados de 1,5 mL arrefecidos:
   21 μL de H2O
   6 μL de tampão de reacção quinase 5x
   1 μL de ATP marcado radioactivamente ("quente")
   2 μL de substrato (~ 5 mg / mL)
   NOTA: Para ensaios de cinase recombinante, o volume pode ser ajustado para acomodar a proteína purificada. Calcular tal que o volume final da reacção seja de 30 μL. Use esta receita para preparar um mestremisturar. Após a recepção do ATP marcado, diluir o stock em H2O para uma actividade específica de 0,01 mCi / mL antes da adição à mistura reaccional.
3. Para inicializar o ensaio, adicionar toda a mistura de reacção à amostra de quinase e incubar a reacção a 30 ° C durante 5 min a 1 h dependendo da actividade da quinase a ser ensaiada.
   NOTA: Quando se trabalha com uma quinase cuja actividade não foi previamente ensaiada, execute um curso de tempo de actividade de quinase com intervalos de 5 minutos entre os pontos de tempo.

3. Terminação da Reação e SDS-PAGE

1. Parar a reacção colocando em gelo e adicionando 7,5 μL de tampão de amostra Laemmli 5x ⁶ .
2. Aquecer a 100 ° C durante 30 s a 2 min em bloco de calor.
3. Toque em rotação e carregue 20 μL por poço em gel SDS-PAGE a 10-15%. Executar o gel o tempo suficiente para separar a cinase eo substrato (tipicamente 1 h a potência constante de 5 W) Certifique-se de manter o aparelho de gel blindado para limitar a exposição a ³² P.
   1. Aqui, use aparelhos de gel caseiros, mas mini-géis padrão comercialmente disponíveis são perfeitamente adequados. Use as dimensões da seguinte forma:
      Géis: 8 cm de largura, 5,5 cm de comprimento (resolução), 1,5 mm de espessura.
      Combs: 15 poços, espessura de 1,5 mm, 2,9 mm de largura, 16 mm de profundidade

4. Gel de coloração e secagem

Cuidado: Para todas as etapas, certifique-se de reduzir a exposição pessoal a ³² P usando blindagem radioativa e usando equipamento de proteção pessoal. Para obter mais informações sobre etapas específicas, algumas referências úteis são incluídas.

1. Remover o gel das placas de vidro / alumina e colocar em 50 mL de mancha de Coomassie (10% de ácido acético glacial, 50% de metanol, 0,25% de corante R-250) durante 1 h num agitador orbital ajustado para 50 rpm. Para este passo use um recipiente que é ligeiramente maior do que o próprio gel. ⁸
2. Mova o gel da mancha para a solução fixadora (10% de ácido acético glacialD, 20% de metanol) a fim de desidratação. Rocha do gel em 600-700 mL de solução de fixação durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm. Coloque pedaços de espuma ou toalhetes de laboratório atados no recipiente com o gel para absorver o corante Coomassie ^{8 , 9} .
3. Remover o gel da solução de fixação e mergulhar em 200 ml de metanol durante 1-2 minutos com agitação suave até que o gel se torne branco leitoso. Isto ajudará a evitar a fissuração durante o passo de secagem.
4. Molhar um pedaço de 14 cm x 14 cm de papel de filtro qualitativo com metanol e colocar em secador de vácuo de gel de laje. Coloque o gel para baixo na face frontal do papel de filtro voltada para cima.
5. Cubra o gel com filme plástico cuidadosamente para evitar rugas e bolhas de ar. Executar o secador durante 1,5 h a 80 ° C. Depois que o vácuo foi alcançado abra a tampa e role para fora todas as bolhas de ar se necessário com um brayer macio da borracha.

5. Autoradiograma e contagens de cintilação

1. RemovaEd gel e anexar um marcador autorad, régua fosforescente ou pontos para o papel de filtro no lado do gel. Se estiver usando pontos, certifique-se de que eles estejam em um padrão assimétrico. Isto irá alinhar o gel com o filme após exposição e desenvolvimento.
2. Use um contador Geiger para verificar a intensidade do sinal. Para sinais mais fracos, a exposição a -70 ° C a -80 ° C com um ecrã de intensificação aumentará a densidade da banda do filme.
3. Em uma sala escura, coloque o gel seco em uma cassete de filme com filme e uma tela intensificadora na seguinte ordem de cima para baixo: gel, filme, tela intensificadora.
4. Conecte a tela de intensificação à tampa da cassete e fita o gel no lugar para fazer este passo mais fácil. A tela de intensificação emite luz quando irradiada pelas partículas beta das ³² P. Estas emissões de luz penetram a película mais eficientemente do que as partículas beta.
   1. Certifique-se de que o comprimento de onda emitido peloLagoas para um comprimento de onda o filme é mais sensível a.
   2. Use um contador Geiger para determinar quanto tempo para deixar a exposição para: se contagem cpm é ~ 100 ou abaixo, tente durante a noite a -70 ° C. Se a contagem for ~ 10.000, comece com uma exposição de 1 h e otimize a partir daí.
5. No final da exposição remova a película e desenvolva-se em um processador de filme médico / de raios-X. Se a exposição foi realizada a -70 a -80 ° C, deixe a cassete aquecer até à temperatura ambiente para minimizar a condensação na película ou remover a película imediatamente antes da formação da condensação ¹⁰ .
6. Colocar o filme sobre o gel / papel de filtro seco e alinhar a imagem do marcador / pontos com os marcadores / pontos no gel seco. Marcar no filme as bandas correspondentes aos padrões de proteína. Rotular os padrões de proteína e quais pistas as reações são para referência futura.
7. Excise as faixas do gel que correspondem às bandas de interesse no filme e colocá-losEm 7 mL de frascos de cintilação. Adicionar 4 mL de fluido de cintilação e contar com contador de cintilação líquida. Confirme se o contador está configurado para monitorar a janela correta do espectro de energia para ³² P.
   NOTA: Certifique-se também de excluir a banda correspondente ao substrato da pista de controle de não quinase. Isto será utilizado para calcular a radiação de fundo que será subtraída de todas as contagens de cintilação da amostra.

6. Análise dos Resultados

NOTA: O autorradiograma fornece uma visualização qualitativa dos resultados. Para uma quantificação precisa, a incorporação de ³² P pode ser medida com um contador de cintilação. Os dados são usualmente expressos em termos de actividade relativa, como mostrado na Figura 1B . Enquanto as condições uniformes forem mantidas para todas as amostras, medições relativas de actividade específica são suficientes para comparar tratamentos.

1. Ao calcular valores absolutos de atividade específica, execute um rigorOtimização de todas as condições de reação, incluindo cinase, substrato e concentrações de ATP fria, a fim de assegurar um intervalo linear de atividade ao longo do tempo ( ex. 2 x [quinase] = 2 x atividade específica). Para quinases com elevada actividade específica, efectuar ensaios com aumento da concentração de substrato, caso a actividade de quinase seja limitada pela quantidade de substrato.
2. Calcular a actividade específica da quinase de interesse em unidades de nanomoles de fosfato transferidos por minuto por mg de cinase.
   1. Subtraia os espaços em branco das cpm nas faixas contadas.
   2. Calcula a decaimento do ATP quente: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0,95 onde t é o número de dias desde a data de referência (deve ser fornecido pelo fornecedor), t _1/2 é o Meia-vida de ³² P, que é de 14,3 dias, e 0,95 reflecte a eficiência do contador de cintilação. Exemplo: se estiver usando ATP quente com 28 dias de idade, o valor de decaimento deve ser 0,245.
   3. Calc(Pmol) de ATP total no ensaio (usualmente isto é igual à quantidade de ATP frio na reacção): volume de ensaio (μL) x [ATP fria] (μM) = ATP total (pmols). Exemplo: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
   4. Calcular cpm / pmol ATP: [μL de ATP quente x (2,2 x 10 ⁷ ) x factor de decaimento] / pmol de ATP frio.
      NOTA: O valor de 2,2 x 10 ⁷ converte 0,01 mCi / μL de ATP em cpm.
   5. Calcular a quantidade de cinase no ensaio em mg. Para quinases recombinantes e quinases imunoprecipitadas, os métodos padrão tais como os ensaios BCA são adequados para determinar as concentrações iniciais. Exemplo: wtERK2 0,0002 μg / μL numa reacção de cinase de 50 μL é 0,01 μg, ou 1 x 10 ^-5 mg.
   6. Calcular o cpm total no ensaio. Reúna 30 μL de reações e administre 20 μL de cada reação em um gel. Multiplicar as cpm contadas (após subtracção em branco) por um factor de volume total de ensaio / volume carregado. Continuando oExemplo, multiplique todas as contagens por 1,5 ou 30/20.
   7. Calcular a actividade específica da cinase ensaiada:
      Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo de ensaio em minutos) / (quantidade de quinase em mg)
      NOTA: A divisão do valor acima em 1000 produz a actividade específica em nanomoles / minuto / mg
3. Calcular quantos mols de fosfato são incorporados num substrato (desde que o seu peso molecular seja conhecido). Isto é usado para determinar o número de fosfositos numa proteína particular depois de a reacção ter terminado.
   Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantidade de substrato em pmoles)

Resultados

Ensaios de quinase WNK1 IP

O WNK1 marcado com Myc foi transfectado em células HEK293 e imunoprecipitado com um anticorpo anti-Myc ¹¹ . O imunoprecipitado exibiu actividade quinase em direcção ao substrato modelo MBP assim como para si próprio ( Figura 1A ). Os mutantes WNK1 foram então testados quanto à actividade de quinase em relação a MBP pelo mesmo método, desta vez empregando...

Discussão

As quinases são uma família diversificada de proteínas que desenvolveram extensa funcionalidade em numerosos contextos e os ensaios de quinase têm sido extremamente úteis no estudo de várias proteínas de sinalização e têm contribuído muito para a nossa compreensão atual da comunicação celular. Notavelmente, o mesmo ensaio básico foi utilizado na caracterização de duas cinases diferentes, apesar das grandes diferenças de estrutura e actividade. A quinase WNK1 contém uma bolsa catalítica atípica em qu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500