Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Zusammenfassung

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- ³² P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Zusammenfassung

Proteinkinasen sind in der Lage, großräumige zelluläre Veränderungen in Reaktion auf komplexe Anregungen von Reizen zu regeln, und viel Aufwand wurde auf die Aufdeckung allosterischer Details ihrer Regulierung gerichtet. Kinasen umfassen Signalisierungsnetze, deren Defekte oft Markenzeichen von mehreren Formen von Krebs und verwandten Erkrankungen sind, was eine Assay-Plattform zur Manipulation von vorgeschalteten regulatorischen Faktoren und zur Validierung von Reaktionsanforderungen, die bei der Suche nach verbesserten Therapeutika kritisch sind, ermöglicht. Hier beschreiben wir einen basischen Kinase-Assay, der sich leicht an spezifische experimentelle Fragen anpassen lässt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Prüfung der Wirkungen von biochemischen und pharmakologischen Wirkstoffen, genetische Manipulationen wie Mutation und Deletion sowie Zellkulturbedingungen und Behandlungen zur Sonde Zell-Signalisierungsmechanismen. Dieser Assay nutzt radiomarkiertes [γ- ³² P] ATP, das quantitative Vergleiche und eine klare Visualisierung der Ergebnisse ermöglicht und mod sein kannFür die Verwendung mit immunpräzipitierten oder rekombinanten Kinase, spezifischen oder typisierten Substraten, über einen weiten Bereich von Reaktionsbedingungen.

Einleitung

Proteinkinasen sind anspruchsvolle Enzyme, die für die Übertragung von zellulären Signalen in entsprechende Reaktionen kritisch sind ¹ . Angesichts ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Prävention oder Förderung von Krankheitszuständen ² sind biochemische Methoden zur Beurteilung der Kinaseaktivität weiterhin mächtige Werkzeuge zur Abgrenzung der Einzelheiten der eukaryotischen Signalisierung ³ . Obwohl Strategien, die Phosphorspezifische Antikörper verwenden, in hohem Maße informativ waren hinsichtlich der Messung der Effekte verschiedener Behandlungsbedingungen auf den Zellsignalisierungsstatus ⁴ , ermöglicht ein Kinase-Assay die Messung der Wirkungen verschiedener Behandlungsbedingungen direkt in Bezug auf die enzymatische Aktivität einer Kinase von interessieren. Zwar gibt es mehrere Möglichkeiten für ähnliche Assays, die keine radioaktiven Materialien verwenden ⁵ , wir setzen uns weiterhin auf diese Methode zur robusten Quantifizierung der Ergebnisse. DortSind zwei typische Anwendungen dieses Assays, die beide aus verschiedenen Gründen wertvoll sind: der immunpräzipitierte (IP) Kinase Assay (Abbildung 1 ) und der rekombinante Proteinkinase-Assay (Abbildung 2 ).

Der IP-Kinase-Assay ist für die Identifizierung von Faktoren, die in der Lage sind, spezifische Proteinkinasen zu aktivieren, sowie die Bewertung von inhibitorischen Behandlungsbedingungen ungeeignet. Kurz gesagt wird eine Epitop-markierte Kinase von Interesse in kultivierte eukaryotische Zellen transfiziert, einer Vielzahl von Behandlungen unterworfen, immunpräzipitiert und auf die Fähigkeit untersucht, radioaktiv markiertes Phosphat in ein Modellsubstrat einzubauen ( z. B. Myelin-basisches Protein (MBP)). IP-Kinase-Assay kann auch ohne Rückgriff auf Überexpression durchgeführt werden, entweder durch Immunpräzipitation von endogenem Protein oder einer beliebigen Anzahl von Genom-Editing-Techniken. Da Behandlungen in Kultur verabreicht werden, kann dieses Verfahren Stimulationen erkennen, die durch mehrere vorgelagerte Faktoren übertragen werdenOder parallele Wege durch In-vitro- Auslesung. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode besteht darin, dass es keine Vorkenntnisse über direkte stromaufwärtige oder nachgeschaltete Faktoren oder Phosphorylierungsstellen erfordert. Darüber hinaus können, sobald spezifische Substrate für eine interessierende Kinase identifiziert worden sind, das gleiche Kinase-Assay-Protokoll mit rekombinanten Komponenten verwendet werden, um spezifische Aktivität gegenüber natürlichen Substraten zu messen und spezifische Phosphorylierungsstellen zu identifizieren, wenn sie mit der Massenspektrometrieanalyse kombiniert werden. Auf diese Weise identifizierte Standorte können mit Kinase-Assays unter Verwendung von Substratmutanten weiter validiert werden. Schließlich kann diese Methode auch zur Erkennung und Messung der Autophosphorylierung verwendet werden.

Das hier bereitgestellte Protokoll nimmt entweder ein optimiertes Proteinreinigungsschema oder Transfektionsverfahren zur Expression einer Affinitätsmarkierungskinase von Interesse in kultivierten Zellen an. Für detailliertere Ausstellungen der Transfektion, Lyse, Immunopräzipitation und Proteinreinigung protOcols, schlagen wir vor, auf Cold Spring Harbor Protocols ^{6 zu} verweisen. Weitere Informationen zur Assayentwicklung und -veränderung finden Sie unter Proteinphosphorylierung: Ausgewählte Methoden in Enzymologie ⁷ .

Protokoll

1. Kinase Purification Resources und allgemeine Immunopräzipitation Pipeline

ANMERKUNG: Kinasen zur Verwendung mit diesem Assay können aus Immunopräzipitaten von kultivierten Zellen oder durch rekombinante Mittel, wie Affinitätsmarkierte Reinigung ^6, bezogen werden. Unten ist ein allgemeines Protokoll für Flag-markierte Immunpräzipitation, die möglicherweise abhängig von der Kinase von Interesse geändert werden müssen. Alles sollte auf Eis gehalten werden, wenn möglich.

1. Füge 2 μl 1 mg / ml Antikörper zu 200 μl Zelllysat (üblicherweise ~ 1 mg / mL Gesamtproteinkonzentration) zu und inkubiere bei 4 ° C für 1 h während des Schwingens.
2. Waschen von Protein A Sepharoseperlen 2-3 mal mit Lysepuffer (siehe unten) durch kurzes Spinnen bei 4 ° C für 30 s bis 1 min bei 5.000 xg ("Touch Spin"), Entfernen des Überstandes mit einer Pipette und Resuspendieren von Perlen in Puffer .
   1. Vorbereitungs-Lyse-Puffer: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl ₂, 1 mM EGTA, 10% Glycerin, 0,2 mM Natriumorthovanadat, 100 mM Natriumfluorid, 50 mM β-Glycerophosphat, 0,1% Triton X 100 oder 0,1% NP-40.
3. Füge 30 μl 50% ige Aufschlämmung von Protein A-Sepharoseperlen in Lysepuffer zu Lysaten hinzu; Bei 4 ° C für 1 h bei Schaukeln inkubieren.
4. Berührungsspin bei 4 ° C, um die Perlen zu pellet und den Überstand zu entfernen.
5. 3 mal mit 1 ml Wulstwaschpuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4) waschen.
6. Waschen Sie einmal mit 1x Kinase-Reaktionspuffer (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl ₂ ). So viel Puffer wie möglich entfernen, ohne Perlen zu entfernen.

2. Initialisierung von Kinase-Reaktionen

ANMERKUNG: Für IP-Kinase-Assays sind ~ 15 μl nicht suspendierte Perlen eine typische Ausgangsprobe. Für rekombinante Proteinkinase-Assays liegen typische Ausgangsmengen im Bereich von 0,1-1,0 μg in 1-10 für 25-50 μl Endreaktionsvolumina. Passen Sie die Volumina der rekombinanten Proteinprobe anS mit dem Puffer gleich sein, den sie vor der Initialisierung des Assays gespeichert haben. Bei der Verwendung von hohen Mengen an Kinase, schließen Sie ein Trägerprotein wie BSA ein, um die Aufrechterhaltung der Proteinstabilität für die Dauer des Assays zu unterstützen.

1. Bereiten Sie den unten angegebenen 5x-Kinase-Reaktionspuffer vor:
   50 mM HEPES pH 8,0
   50 mM MgCl & sub2 _;
   50 mM Benzamidin (Protease-Inhibitor)
   50 mM DTT (Reduktionsmittel)
   250 μM ATP (unmarkiert oder "kalt")
2. Halten Sie Kinaseproben auf Eis in 1,5 ml Röhrchen. Bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung in getrennten, gekühlten 1,5 ml-Röhrchen vor:
   21 & mgr; l H ₂ O
   6 & mgr; l 5 × Kinase-Reaktionspuffer
   1 & mgr; l radioaktiv markiertes (& ldquor; heißes ") ATP
   2 & mgr; l Substrat (& ndash; 5 mg / ml)
   ANMERKUNG: Für rekombinante Kinase-Assays kann das Volumen angepasst werden, um gereinigtes Protein unterzubringen. Berechnen Sie, dass das Endreaktionsvolumen 30 μl beträgt. Verwenden Sie dieses Rezept, um einen Master vorzubereitenmischen. Nach dem Empfang von markiertem ATP, verdünntem Bestand in H & _sub2 ; O zu einer spezifischen Aktivität von 0,01 mCi / & mgr; l vor der Zugabe zu Reaktionsmischung.
3. Um den Assay zu initialisieren, wird die gesamte Reaktionsmischung zur Kinaseprobe zugegeben und die Reaktion bei 30 ° C für 5 min bis 1 h inkubiert, abhängig von der Aktivität der zu untersuchenden Kinase.
   HINWEIS: Bei der Arbeit mit einer Kinase, deren Aktivität bisher nicht getestet wurde, führen Sie einen zeitlichen Verlauf der Kinaseaktivität mit 5 Minuten Intervallen zwischen den Zeitpunkten durch.

3. Reaktionsbeendigung und SDS-PAGE

1. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie auf Eis setzen und 7,5 μl 5x Laemmli Probenpuffer ⁶ hinzufügen.
2. Hitze bei 100 ° C für 30 s bis 2 min in Hitzeblock.
3. Touch-Spin und laden 20 μL pro gut auf 10-15% SDS-PAGE Gel. Führen Sie das Gel lang genug, um die Kinase und das Substrat zu trennen (typischerweise 1 h bei konstanter Leistung von 5 W). Achten Sie darauf, dass die Gel-Apparatur abgeschirmt ist, um die Exposition gegenüber ³² zu begrenzen P.
   1. Hier verwenden Sie hausgemachte Gelapparate, aber handelsübliche Mini-Gele eignen sich hervorragend. Verwenden Sie die Maße wie folgt:
      Gels: 8 cm Breite, 5,5 cm Länge (Auflösen), 1,5 mm Dicke.
      Kämme: 15 Vertiefungen, 1,5 mm Dicke, 2,9 mm Breite, 16 mm Tiefe

4. Gel-Färbung und Trocknung

Achtung: Für alle Schritte unbedingt die persönliche Exposition gegenüber ³² P durch radioaktive Abschirmung und das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung reduzieren. Für weitere Informationen zu bestimmten Schritten sind einige hilfreiche Referenzen enthalten.

1. Entfernen Sie das Gel aus Glas / Aluminiumoxid-Platten und legen Sie es in 50 ml Coomassie-Fleck (10% Eisessig, 50% Methanol, 0,25% R-250-Farbstoff) für 1 h auf einem Orbitalschüttler auf 50 U / min. Für diesen Schritt einen Behälter verwenden, der etwas größer ist als das Gel selbst. ⁸
2. Das Gel vom Fleck zur Fixierlösung bewegen (10% Eisessig aciD, 20% Methanol), um zu entfärben. Fang das Gel in 600-700 ml Fixierlösung über Nacht auf Orbitalschüttler bei 50 U / min. Legen Sie Stücke von Schaum oder geknoteten Labor-Wischtücher in den Behälter mit dem Gel, um den Coomassie-Farbstoff ^{8 , 9} zu absorbieren.
3. Gel von der Fixierlösung entfernen und in 200 ml Methanol für 1-2 min unter leichtem Rühren einweichen, bis das Gel milchig weiß wird. Dies wird dazu beitragen, Risse während des Trocknungsschrittes zu verhindern.
4. Nass ein 14 cm x 14 cm Stück qualitatives Filterpapier mit Methanol und auf Platten-Gel-Vakuumtrockner stellen. Legen Sie das Gel auf die Filterpapier-Vorderseite nach oben.
5. Bedecken Sie das Gel mit Plastikfolie sorgfältig, um Falten und Luftblasen zu vermeiden. Den Trockner für 1,5 h bei 80 ° C laufen lassen. Nachdem das Vakuum erreicht wurde, öffnen Sie den Deckel und rollen alle Luftblasen aus, wenn nötig mit einem weichen Gummibolzen.

5. Autoradiogramm und Szintillationszählungen

1. Dri entfernenEd Gel und befestigen Sie eine autorad Marker, phosphoreszierende Lineal oder Punkte auf das Filterpapier auf der Seite des Gels. Wenn Sie Punkte verwenden, stellen Sie sicher, dass sie in einem asymmetrischen Muster sind. Dadurch wird das Gel nach Belichtung und Entwicklung mit dem Film ausgerichtet.
2. Verwenden Sie einen Geiger-Zähler, um die Intensität des Signals zu überprüfen. Für schwächere Signale belichtet die Belichtung bei -70 ° C bis -80 ° C mit einem Verstärkungsschirm die Filmbanddichte.
3. In einem dunklen Raum getrocknetes Gel in eine Filmkassette mit Film und einem Verstärkerschirm in der folgenden Reihenfolge von oben nach unten: Gel, Film, Verstärkerschirm.
4. Befestigen Sie den Verstärkerschirm am Deckel der Kassette und kleben Sie das Gel an Ort und Stelle, um diesen Schritt zu erleichtern. Der Verstärkungsschirm emittiert Licht, wenn es von den Beta-Partikeln aus dem ³² P bestrahlt wird. Diese Lichtemissionen durchdringen den Film effizienter als die Beta-Partikel.
   1. Vergewissern Sie sich, dass die vom Verstärkungsschirm emittierte Wellenlänge korrespondiertTeiche auf eine Wellenlänge, auf die der Film am meisten empfindlich ist.
   2. Benutze einen Geiger-Zähler, um festzustellen, wie lange die Exposition belassen wird: Wenn die cpm-Zahl ~ 100 oder darunter ist, versuchen Sie es bei Nacht bei -70 ° C. Wenn die Zählung ~ 10.000 ist, beginnen Sie mit einer 1 h Belichtung und optimieren von dort aus.
5. Am Ende der Belichtung entfernen Sie den Film und entwickeln sich in einem medizinischen / Röntgenfilmprozessor. Wenn die Belichtung bei -70 bis -80 ° C durchgeführt wurde, lassen Sie die Kassette auf Raumtemperatur erwärmen, um die Kondensation auf dem Film zu minimieren oder den Film unmittelbar vor der Kondenswasserbildung zu entfernen. ¹⁰ .
6. Legen Sie den Film über das getrocknete Gel / Filterpapier und richten Sie das Bild der Marker / Punkte mit den Markern / Punkten auf dem getrockneten Gel aus. Markieren Sie auf dem Film die Bänder entsprechend den Proteinstandards. Beschriften Sie die Protein-Standards und welche Spuren sind die Reaktionen für zukünftige Referenz.
7. Heben Sie die Bänder aus dem Gel, die Bands von Interesse auf dem Film entsprechen und legen Sie sieIn 7 ml Szintillationsfläschchen. Füge 4 ml Szintillationsflüssigkeit hinzu und zähle mit Flüssigkeitsszintillationszähler. Bestätigen Sie, dass der Zähler eingestellt ist, um das korrekte Energiespektrumfenster für ³² P zu ^überwachen .
   HINWEIS: Achten Sie darauf, auch das Band, das dem Substrat entspricht, von der Nicht-Kinase-Kontrollspur zu überschreiten. Dies wird verwendet, um Hintergrundstrahlung zu berechnen, die von allen Szintillationszählungen subtrahiert wird.

6. Analyse der Ergebnisse

HINWEIS: Das Autoradiogramm liefert eine qualitative Visualisierung der Ergebnisse. Für eine genaue Quantifizierung kann der ³² P-Einbau mit einem Szintillationszähler gemessen werden. Die Daten werden üblicherweise in Bezug auf die relative Aktivität ausgedrückt, wie in 1B gezeigt . Solange für alle Proben einheitliche Bedingungen eingehalten werden, reichen relative Messungen der spezifischen Aktivität aus, um Behandlungen zu vergleichen.

1. Bei der Berechnung absoluter spezifischer Aktivitätswerte eine Strenge ausführenOptimierung aller Reaktionsbedingungen, einschließlich Kinase-, Substrat- und Kalt-ATP-Konzentrationen, um einen linearen Wirkungsbereich über einen Zeitverlauf ( zB 2 x [Kinase] = 2 x spezifische Aktivität) zu gewährleisten. Für Kinasen mit hoher spezifischer Aktivität führen Assays mit erhöhter Substratkonzentration durch, falls die Kinaseaktivität durch die Menge des Substrats begrenzt ist.
2. Berechnen Sie die spezifische Aktivität der Kinase von Interesse in Einheiten von Nanomol Phosphat übertragen pro Minute pro mg Kinase.
   1. Subtrahieren Sie Leerzeichen aus der cpm in den gezählten Bändern.
   2. Berechnen Sie den Zerfall der heißen ATP: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0,95 wobei t die Anzahl der Tage seit dem Stichtag ist (sollte vom Verkäufer bereitgestellt werden), t _1/2 ist der Halbwertszeit von ³² P, was 14,3 Tage beträgt, und 0,95 spiegelt die Effizienz des Szintillationszählers wider. Beispiel: Bei Verwendung von heißem ATP, das 28 Tage alt ist, sollte der Zerfallswert 0,245 sein.
   3. BerechnetUlieren die Picomole (pmol) des Gesamt-ATP im Assay (üblicherweise ist dies gleich der Menge an kaltem ATP in der Reaktion): Assayvolumen (μL) x [kaltes ATP] (μM) = Gesamt-ATP (pmols). Beispiel: 30 & mgr; l x 50 & mgr; M = 1500 pmol
   4. Berechnen Sie cpm / pmol ATP: [μL heißer ATP x (2,2 x 10 ⁷ ) x Zerfallsfaktor] / pmol kaltes ATP.
      HINWEIS: Der Wert von 2,2 x 10 ⁷ wandelt 0,01 mCi / μL ATP zu cpm.
   5. Berechnen Sie die Menge an Kinase im Assay in mg. Sowohl für rekombinante Kinase als auch für immunpräzipitierte Kinasen sind Standardverfahren wie BCA-Assays geeignet, die Ausgangskonzentrationen zu bestimmen. Beispiel: wtERK2 0,0002 μg / μL in einer 50 μl Kinase-Reaktion beträgt 0,01 μg oder 1 x 10 ^-5 mg.
   6. Berechnen Sie insgesamt cpm im Assay. Zusammensetzen von 30 & mgr; l Reaktionen und Durchführen von 20 & mgr; l von jeder Reaktion auf einem Gel. Multiplizieren Sie die cpm gezählt (nach leerer Subtraktion) um einen Faktor des gesamten Assayvolumens / Volumen geladen. Fortsetzung der oben genanntenBeispiel, multiplizieren Sie alle Zählungen um 1,5 oder 30/20.
   7. Berechnen Sie die spezifische Aktivität der getesteten Kinase:
      Gesamt-cpm im Assay) / (cpm / pmol ATP) / (Testzeit in Minuten) / (Menge an Kinase in mg)
      HINWEIS: Die Aufteilung des obigen Wertes um 1.000 ergibt die spezifische Aktivität in Nanomolen / Minute / mg
3. Berechnen Sie, wie viele Mol Phosphat in ein Substrat eingebaut werden (solange sein Molekulargewicht bekannt ist). Dies wird verwendet, um die Anzahl der Phosphosite auf einem bestimmten Protein zu bestimmen, sobald die Reaktion abgeschlossen ist.
   Gesamt-cpm im Assay) / (cpm / pmol ATP)] / (Menge an Substrat in pmols)

Ergebnisse

WNK1 IP-Kinase-Assays

Myc-markiertes WNK1 wurde in HEK293-Zellen transfiziert und mit einem Anti-Myc-Antikörper ¹¹ immunpräzipitiert. Das Immunpräzipitat zeigte die Kinaseaktivität gegenüber dem Modellsubstrat MBP sowie zu sich selbst (Abbildung 1A ). WNK1-Mutanten wurden dann für die Kinaseaktivität gegenüber MBP nach demselben Verfahren getestet, wobei diesmal GST-markierte Konst...

Diskussion

Kinasen sind eine vielfältige Familie von Proteinen, die in zahlreichen Kontexten umfangreiche Funktionalität entwickelt haben, und Kinase-Assays waren bei der Untersuchung mehrerer Signalproteine ​​unglaublich nützlich und haben zu unserem aktuellen Verständnis der zellulären Kommunikation stark beigetragen. Bemerkenswerterweise wurde der gleiche Grundtest bei der Charakterisierung von zwei verschiedenen Kinasen trotz großer Unterschiede in Struktur und Aktivität verwendet. Die WNK1-Kinase enthält eine atyp...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500