Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato

Riepilogo

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Abstract

Le proteine ​​chinasi sono in grado di governare cambiamenti cellulari su vasta scala in risposta a complessi array di stimoli, e molto sforzo è stato indirizzato a scoprire dettagli allosterici della loro regolazione. Le cinasi comprendono reti di segnalazione i cui difetti sono spesso segni distintivi di molteplici forme di cancro e malattie correlate, rendendo una piattaforma di analisi suscettibile di manipolare i fattori regolatori a monte e di convalida dei requisiti di reazione critici nella ricerca di terapie migliorate. Qui descriviamo un esame di base di chinasi che può essere facilmente adattato a specifiche questioni sperimentali, tra cui ma non limitandosi a verificare gli effetti degli agenti biochimici e farmacologici, manipolazioni genetiche come la mutazione e la delezione, nonché le condizioni di coltura cellulare e trattamenti a sonda Meccanismi di segnalazione cellulare. Questo saggio utilizza l'ATP [γ- ³² P] radiomarcato, che consente confronti quantitativi e una chiara visualizzazione dei risultati e può essere modSe utilizzati con chinasi immunoprecipitati o ricombinanti, substrati specifici o tipizzati, in una vasta gamma di condizioni di reazione.

Introduzione

Le proteine ​​chinasi sono enzimi sofisticati critici per la trasmissione di segnali cellulari in risposte appropriate ¹ . Considerati i loro ruoli nel mantenimento dell'omeostasi e nella prevenzione o promozione degli stati di malattia ² , i metodi biochimici per la valutazione dell'attività di chinasi continuano ad essere strumenti potenti per delineare i particolari della segnalazione eucariotica ³ . Sebbene le strategie che utilizzino anticorpi specifici fosfo-specifici siano stati altamente informativi in ​​termini di misura degli effetti delle diverse condizioni di trattamento sullo stato di segnalazione cellulare ⁴ , un test di chinasi consente di misurare gli effetti di diverse condizioni di trattamento direttamente in termini di attività enzimatica di una chinasi di interesse. Mentre ci sono diverse opzioni per analisi simili che non utilizzano materiali radioattivi ⁵ , continuiamo a contare su questo metodo per una robusta quantità di risultati. LàSono due applicazioni tipiche di questo saggio, sia preziose per ragioni diverse: il dosaggio immunoprecipitato (IP) di chinasi ( Figura 1 ) e il test della chinasi della proteina ricombinante ( Figura 2 ).

Il dosaggio di IP chinasi è estremamente utile per identificare fattori capaci di attivare specifiche chinasi proteiche, nonché condizioni di trattamento inibitorie di misura. In breve, una chinasi di interesse etichettata con epitopo viene trasfettata in cellule eucariotiche colte, sottoposte a una varietà di trattamenti, immunoprecipitati e analizzati per la capacità di incorporare fosfato radiomarcato in un substrato di modello ( ad es. Proteina di base di mielina (MBP)). Il test di kinasi IP può anche essere eseguito senza ricorrere all'eccessiva espressione, sia mediante immunoprecipitazione della proteina endogena, o qualsiasi altro numero di tecniche di editing genomico. Poiché i trattamenti vengono somministrati in coltura, questo metodo può rilevare stimoli trasmessi attraverso più fattori a monteO percorsi paralleli mediante lettura in vitro . Un importante vantaggio di questo metodo è che non richiede una conoscenza preliminare di fattori diretti a monte oa valle o siti di fosforilazione in esso. Inoltre, una volta individuati substrati specifici per una chinasi di interesse, è possibile utilizzare lo stesso protocollo di analisi chinasi con componenti ricombinanti per misurare l'attività specifica nei confronti dei substrati naturali e identificare siti specifici di fosforilazione in combinazione con l'analisi di spettrometria di massa. I siti identificati in questo modo possono essere ulteriormente convalidati con i test di chinasi utilizzando mutanti del substrato. Infine, questo metodo può essere usato anche per rilevare e misurare l'autofosforilazione.

Il protocollo fornito qui presuppone uno schema di purificazione della proteina ottimizzata o metodo di trasfezione per esprimere una chinasi di affinità interessata nelle cellule colte. Per esposizioni più dettagliate di trasfezione, lisi, immunoprecipitazione e proteina purificazione protOcols, suggeriamo di riferirsi ai protocolli Cold Spring Harbour ⁶ . Per ulteriori informazioni riguardanti lo sviluppo e la modifica del test, consultare Proteine ​​Phosphorylation: Metodi selezionati in Enzimologia ⁷ .

Protocollo

1. Risorse di depurazione delle chinasi e pipeline di immunoprecipitazione generale

NOTA: Le cinasi usate con questo dosaggio possono essere provenienti da immunoprecipitati di cellule colte o mediante mezzi ricombinanti come la purificazione affinità ⁶ . Di seguito è riportato un protocollo generale per l'immunoprecipitazione contrassegnata dalla bandiera che può essere necessario modificare a seconda della chinasi di interesse. Tutto dovrebbe essere mantenuto sul ghiaccio quando possibile.

1. Aggiungere 2 μL di 1 mg / mL di anticorpi a 200 μL di lisati cellulari (di solito ~ 1 mg / ml di concentrazione totale di proteine) e incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo.
2. La proteina di lavaggio Una seperarosa si perda 2-3 volte con il tampone di lisi (vedi sotto) brevettando brevemente a 4 ° C per 30 s a 1 min a 5.000 xg ("spin di tocco"), rimuovendo il surnatante con una pipetta e riutilizzando le perle in tampone .
   1. Preparare il tampone di lisi: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glicerolo, 0,2 mM orthovanadato di sodio, 100 mM fluoruro di sodio, 50 mM β-glicerofosfato, 0,1% Triton X 100 o 0,1% NP-40.
3. Aggiungere 30 μL di sospensione del 50% di branoli di seperarina di proteina A nel lysis buffer a lisati; Incubare a 4 ° C per 1 ora durante il dondolo.
4. Toccare lo spin a 4 ° C per far pelliccare le perle e rimuovere il surnatante.
5. Lavare 3 volte con 1 mL di tampone di lavaggio a goccia (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).
6. Lavare una volta con tampone di reazione di chinasi 1x (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Rimuove il maggior numero di tamponi possibile senza rimuovere le perle.

2. Inizializzare le reazioni della chinasi

NOTA: Per i dosaggi di IP chinasi, ~ 15 μL di branelli non sospesi è un tipico campione di partenza. Per i dosaggi ricombinanti della proteina chinasi, gli importi tipici di partenza sono compresi tra 0,1 e 1,0 μg in 1-10 per 25-50 μL di volumi di reazione finale. Regolare i volumi del campione proteico ricombinanteS per essere uguale al buffer che sono memorizzati prima di inizializzare il saggio. Quando si utilizzano alte quantità di chinasi, includere una proteina portante come BSA per aiutare a mantenere la stabilità proteica per la durata del saggio.

1. Preparare il 5x reazione di reazione di chinasi sotto riportato:
   50 mM HEPES pH 8,0
   50 mM di MgCl2
   50 mM Benzamidina (inibitore della proteasi)
   50 mM DTT (agente di riduzione)
   250 μM ATP (non etichettati o "freddi")
2. Tenere i campioni di chinasi su ghiaccio in tubi da 1,5 ml. Preparare la seguente miscela di reazione in tubi separati, refrigerati di 1,5 mL:
   21 μl H ₂ O
   6 μL di tampone di reazione di chinasi 5x
   1 μl ATP radiomarcato ("caldo")
   2 μL di substrato (~ 5 mg / ml)
   NOTA: per i dosaggi ricombinanti di chinasi, il volume può essere regolato per contenere proteine ​​purificate. Calcolare tale che il volume di reazione finale è di 30 μL. Utilizza questa ricetta per preparare un maestromescolare. Al ricevimento di ATP etichettato, diluire la riserva in H ₂ O ad un'attività specifica di 0,01 mCi / μl prima di aggiungere alla miscela di reazione.
3. Per inizializzare il saggio, aggiungere tutta la miscela di reazione al campione di chinasi e incubare la reazione a 30 ° C per 5 minuti a 1 h a seconda dell'attività di chinasi in fase di analisi.
   NOTA: quando si lavora con una chinasi la cui attività non è stata precedentemente misurata, eseguire un tempo di attività di chinasi con intervalli di 5 minuti tra i punti di tempo.

3. Terminazione di reazione e SDS-PAGE

1. Arrestare la reazione mettendo in ghiaccio e aggiungendo 7,5 μL di tampone di campione 5x Laemmli ⁶ .
2. Scaldare a 100 ° C per 30 secondi fino a 2 minuti nel blocco termico.
3. Toccare lo spin e caricare 20 μL per pozzetto sul 10-15% SDS-PAGE gel. Far eseguire gel sufficientemente a lungo per separare la chinasi e il substrato (tipicamente 1 h a potenza costante di 5 W). Assicurarsi di mantenere schermato l'apparecchiatura gel per limitare l'esposizione a ³² P.
   1. Qui usi gli apparecchi di gelatina fatti in casa, ma i minigelchi standard commercialmente disponibili sono perfettamente adatti. Utilizzare le dimensioni come segue:
      Gel: 8 cm di larghezza, 5,5 cm di lunghezza (risolvendo), spessore 1,5 mm.
      Pettini: 15 pozzetti, spessore 1,5 mm, larghezza 2,9 mm, profondità 16 mm

4. Colorazione e asciugatura del gel

Attenzione: Per tutti i passaggi, assicurarsi di ridurre l'esposizione personale a ³² P utilizzando schermatura radioattiva e indossare dispositivi di protezione individuale. Per ulteriori informazioni su passaggi specifici sono inclusi alcuni riferimenti utili.

1. Togliere il gel da lastre di vetro / allumina e mettere in 50 ml di colorante Coomassie (10% acido acetico glaciale, 50% metanolo, 0,25% R-250) per 1 ora su un agitatore orbitale impostato a 50 giri / min. Per questo passo utilizzare un contenitore leggermente più grande del gel stesso. ⁸
2. Spostare il gel dalla macchia alla soluzione di fissaggio (10% acetato glaciale acciD, 20% metanolo) al fine di de-macchia. Far scivolare il gel in 600-700 ml di soluzione di fissaggio durante la notte su agitatore orbitale a 50 giri / min. Posizionare pezzi di spugna o salviette di laboratorio annodate nel contenitore con il gel per assorbire il colorante Coomassie ^{8 , 9} .
3. Togliere il gel dalla soluzione di fissaggio e immergere in 200 mL di metanolo per 1-2 minuti con agitazione gentile fino a quando il gel si trasforma in bianco latteo. Ciò contribuirà a prevenire fessurazioni durante la fase di asciugatura.
4. Bagnare un pezzo di carta filtrante qualitativa da 14 cm x 14 cm con metanolo e mettere su asciugatrice a vuoto a gel di lastre. Posare il gel sul lato frontale della carta filtrante rivolto verso l'alto.
5. Coprire con cura il gel con un involucro di plastica per evitare le rughe e le bolle d'aria. Azionare l'asciugatrice per 1,5 ore a 80 ° C. Dopo aver raggiunto il vuoto, aprire il coperchio ed estrarre eventuali bolle d'aria, se necessario, con un soffietto in gomma morbida.

5. Autoradiogrammi e contatti di scintillazione

1. Rimuovi driEd attaccare un indicatore di autoradio, righello fosforescente o punti sulla carta filtrante sul lato del gel. Se si usano i puntini verificare che siano in un modello asimmetrico. Questo allineerà il gel con il film dopo l'esposizione e lo sviluppo.
2. Utilizzare un contatore Geiger per controllare l'intensità del segnale. Per un segnale più debole di esposizione a -70 ° C a -80 ° C con uno schermo di intensificazione aumenterà la densità della banda del film.
3. In una stanza buia mettere il gel asciugato in una cassetta con film e uno schermo intensificante nel seguente ordine dall'alto verso il basso: gel, film, schermo intensificante.
4. Fissare lo schermo di intensificazione al coperchio della cassetta e applicare il gel sul posto per facilitare questo passaggio. Lo schermo intensificante emette luce quando irradiato dalle particelle beta dal ³² P. Le emissioni di luce penetrano in modo più efficace del film rispetto alle particelle beta.
   1. Assicurarsi che la lunghezza d'onda emessa dallo schermo di intensificazione correscaStagni ad una lunghezza d'onda il film è più sensibile a.
   2. Utilizzare un contatore Geiger per determinare quanto tempo lasciare l'esposizione per: se il numero di cpm è di ~ 100 o inferiore, prova a notte a -70 ° C. Se il conteggio è di ~ 10.000, iniziare con un'esposizione di 1h e ottimizzare da lì.
5. Alla conclusione dell'esposizione rimuovere il film e svilupparsi in un processore medico / a raggi X. Se l'esposizione è stata eseguita a -70 - -80 ° C, lasciare che la cassetta si riscaldi a temperatura ambiente per minimizzare la condensa sulla pellicola o rimuovere la pellicola immediatamente prima delle forme di condensazione ¹⁰ .
6. Posare la pellicola sopra il gel essiccato / carta filtrante e allineare l'immagine del marker / punti con i marcatori / punti sul gel essiccato. Segna sul film le bande corrispondenti agli standard proteici. Etichettare le norme proteiche e quali corsie le reazioni sono per riferimento futuro.
7. Incise le bande del gel che corrispondono a bande di interesse sul film e li piazzanoIn fiale di scintillazione da 7 ml. Aggiungere 4 ml di liquido di scintillazione e contare con contatore di scintillazione liquida. Confermare che il contatore sia impostato per monitorare la corretta finestra dello spettro di energia per ³² P.
   NOTA: Assicurarsi inoltre di accisciare la banda corrispondente al substrato dalla corsia di controllo non-chinasi. Questo verrà utilizzato per calcolare la radiazione di sfondo che verrà sottratta da tutti i conteggi di scintillazione del campione.

6. Analisi dei risultati

NOTA: L'autoradiogramma fornisce una visualizzazione qualitativa dei risultati. Per una quantificazione accurata, l'incorporazione di ³² P può essere misurata con un contatore di scintillazione. I dati sono di solito espressi in termini di attività relativa, come mostrato nella Figura 1B . Fintanto che vengono mantenute condizioni uniformi per tutti i campioni, le misure relative di attività specifiche sono sufficienti per confrontare i trattamenti.

1. Nel calcolo di valori assoluti specifici di attività, eseguire un rigoreOttimizzazione di tutte le condizioni di reazione, inclusa la chinasi, il substrato e le concentrazioni di ATP fredde, al fine di garantire una gamma lineare di attività in un corso temporale ( es. 2 x [chinasi] = 2 x attività specifica). Per le chinasi con elevata attività specifica, eseguire test con concentrazione di substrato aumentato in caso di attività cinasi china è limitata dalla quantità di substrato.
2. Calcolare l'attività specifica della chinasi di interesse in unità di nanomoli fosfato trasferito per min per mg chinasi.
   1. Sottrarre gli spazi dal cpm nelle bande contate.
   2. Calcola il decadimento di ATP caldo: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0.95 dove t è il numero di giorni dalla data di riferimento (dovrebbe essere fornito dal venditore), t _1/2 L'emivita di ³² P, che è di 14,3 giorni e 0,95 riflette l'efficienza del contatore di scintillazione. Esempio: se si utilizza ATP caldo che è di 28 giorni, il valore di decadimento dovrebbe essere 0.245.
   3. CalcInserire il pikomole (pmol) del totale ATP nel saggio (di solito è uguale alla quantità di ATP freddo nella reazione): volume di analisi (μL) x [ATP freddo] (μM) = totale ATP (pmols). Esempio: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
   4. Calcolare cpm / pmol ATP: [μL di caldo ATP x (2,2 x 10 ⁷ ) x fattore di decadimento] / pmol di ATP freddo.
      NOTA: Il valore di 2,2 x 10 ⁷ converte 0,01 mCi / μL di ATP a cpm.
   5. Calcola la quantità di chinasi nel dosaggio in mg. Per entrambe le chinasi ricombinanti e le chinasi immunoprecipitate, metodi standard come i test BCA sono idonei a determinare le concentrazioni di partenza. Esempio: wtERK2 0,0002 μg / μL in una reazione di chinasi di 50 μL è 0,01 μg, o 1 x 10 ^-5 mg.
   6. Calcolare il cpm totale nel saggio. Assemblare 30 μL di reazioni e eseguire 20 μL da ogni reazione su un gel. Moltiplicare il cpm contato (dopo la sottrazione di vuoto) per un fattore di volume / volume di dosaggio totale caricato. Proseguendo quanto sopraEsempio, moltiplicare tutti i conteggi di 1,5 o 30/20.
   7. Calcolare l'attività specifica della chinasi assayed:
      Totale cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo di analisi in minuti) / (quantità di chinasi in mg)
      NOTA: La suddivisione del valore sopra riportato per 1.000 rende l'attività specifica in nanomoli / minuto / mg
3. Calcolare quanti moli di fosfato sono incorporati in un substrato (fino a quando il suo peso molecolare è noto). Questo viene utilizzato per determinare il numero di fosfosi su una particolare proteina una volta che la reazione è stata completata.
   Total cpm nel saggio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantità di substrato in pmols)

Risultati

WNK1 IP kinasi

Myc-tagged WNK1 è stato trasfettato in cellule HEK293 e immunoprecipitato con un anticorpo anti-Myc ¹¹ . L'immunoprecipitato ha mostrato l'attività di chinasi verso il substrato del modello MBP e verso di sé ( Figura 1A ). I mutanti WNK1 sono stati quindi testati per l'attività di chinasi verso MBP con lo stesso metodo, questa volta impiegando costrutti con G...

Discussione

Le cinasi sono una famiglia diversificata di proteine ​​che hanno evoluto un'ampia funzionalità in numerosi contesti e i dosaggi di chinasi sono stati incredibilmente utili nello studio di diverse proteine ​​di segnalazione e hanno contribuito notevolmente alla nostra attuale comprensione della comunicazione cellulare. In particolare, lo stesso test di base è stato utilizzato per caratterizzare due chinasi disparati nonostante le principali differenze nella struttura e nell'attività. La chinasi WNK1 c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500