用放射性标记的ATP测定蛋白激酶活性

摘要

蛋白激酶是对于细胞间和细胞内信号转导至关重要的高度进化的信号酶和支架。我们提出了通过使用放射性标记的三磷酸腺苷（[γ- ³² P] ATP）测量激酶活性的方案，这是一种有助于阐明细胞信号调节的可靠方法。

摘要

蛋白激酶能够响应于复杂的刺激阵列来控制大规模细胞变化，并且大量努力旨在揭示其调节的变构细节。激酶包括信号网络，其缺陷通常是多种形式的癌症和相关疾病的标志，使得能够操纵上游调节因子的测定平台和对于改进治疗学的研究至关重要的反应要求的验证。在这里，我们描述了一个基本的激酶测定，可以很容易地适应特定的实验问题，包括但不限于测试生物化学和药理学的作用，遗传操作如突变和缺失，以及细胞培养条件和治疗探针细胞信号传导机制。该测定使用放射性标记的[γ- ³² P] ATP，其允许定量比较和清楚的结果可视化，并且可以是mod如果用于免疫沉淀或重组激酶，特异性或典型的底物，在广泛的反应条件下使用。

引言

蛋白激酶是将细胞信号传递到适当的反应中所必需的复杂酶。鉴于其在维持体内平衡和预防或促进疾病状态方面的作用² ，用于评估激酶活性的生物化学方法继续是描绘真核信号传导³的特征的有力工具。尽管使用磷酸特异性抗体的策略在测量不同治疗条件对细胞信号传导状态的影响方面已经具有高度的信息，但激酶测定允许直接根据激酶的酶活性来测量不同治疗条件的影响利益。虽然对于不使用放射性物质的类似测定法有几种选择⁵ ，我们仍然依靠这种方法对结果进行稳健的定量。那里是该测定的两个典型应用，两者都有价值的不同原因:免疫沉淀（IP）激酶测定（ 图1 ）和重组蛋白激酶测定（ 图2 ）。

IP激酶测定对于识别能够激活特异性蛋白激酶的因子以及测量抑制性治疗条件非常有用。简言之，将感兴趣的表位标记的激酶转染到培养的真核细胞中，进行各种处理，免疫沉淀，并测定将放射性标记的磷酸掺入模型底物（ 例如髓磷脂碱性蛋白（MBP））的能力。也可以通过免疫沉淀内源蛋白或任何数量的基因组编辑技术来进行IP激酶测定而不诉诸过表达。因为治疗是在文化中进行的，所以这种方法可以检测通过多个上游因素传播的刺激或通过体外读出的平行通路。该方法的一个主要优点是其不需要在其中直接上游或下游因子或磷酸化位点的先验知识。此外，一旦已经鉴定了感兴趣的激酶的特异性底物，与重组组分可以使用相同的激酶测定方案，以测量与天然底物的比活性，并在与质谱分析结合时鉴定特异性磷酸化位点。使用底物突变体的激酶测定可以进一步验证以这种方式鉴定的位点。最后，该方法也可用于检测和测量自磷酸化。

这里提供的方案假设用于在培养细胞中表达感兴趣的亲和标记的激酶的优化的蛋白质纯化方案或转染方法。有关转染，裂解，免疫沉淀和蛋白质纯化的更详细的论述我们建议参考Cold Spring Harbor Protocols ⁶ 。有关测定开发和修饰的更多信息，请参阅蛋白质磷酸化:选择的酶学方法⁷ 。

研究方案

激酶纯化资源和一般免疫沉淀管道

注意:用于该测定的激酶可以来源于培养细胞的免疫沉淀物，或通过重组方法如亲和标记的纯化⁶ 。以下是标记免疫沉淀的通用方案，其可能必须根据感兴趣的激酶进行修饰。一切尽可能保持在冰上。

1. 向200μL细胞裂解液（通常〜1 mg / mL总蛋白浓度）中加入2μL1 mg / mL抗体，并在4℃下摇摆孵育1小时。
2. 通过在5,000 xg（"触摸旋转"）下在4℃下短暂旋转30秒至1分钟，将蛋白质琼脂糖珠洗涤2-3次，并用移液管除去上清液，并将缓冲液重悬于缓冲液。
   1. 制备裂解缓冲液:50mM HEPES pH 7.7,150mM NaCl，1.5mM MgCl ₂，1mM EGTA，10％甘油，0.2mM原钒酸钠，100mM氟化钠，50mMβ-甘油磷酸酯，0.1％Triton X 100或0.1％NP-40。
3. 将30μL50％的蛋白A琼脂糖凝胶珠浆液在裂解缓冲液中加入到裂解物中;在4℃下孵育1小时，同时摇摆。
4. 在4℃下触摸旋转以沉淀珠并除去上清液。
5. 用1mL珠洗涤缓冲液（1M NaCl，20mM Tris pH 7.4）洗涤3次。
6. 用1x激酶反应缓冲液（10mM HEPES pH8.0,10mM MgCl ₂ ）洗涤一次。去除尽可能多的缓冲液，而不去除珠子。

2.初始化激酶反应

注意:对于IP激酶测定，〜15μL的悬浮珠是典型的起始样品。对于重组蛋白激酶测定，典型的起始量范围为1-10至25-50μL最终反应体积中的1-10-1.0μg。调整重组蛋白质样品的体积s等于其在初始化测定之前存储的缓冲液。当使用大量的激酶时，包括载体蛋白如BSA以帮助在测定期间保持蛋白质的稳定性。

1. 准备下面给出的5x激酶反应缓冲液:
   50mM HEPES pH 8.0
   50mM MgCl ₂
   50mM苄脒（蛋白酶抑制剂）
   50mM DTT（还原剂）
   ATP（未标记或"冷"）250μM
2. 将激酶样品保存在1.5 mL管中。将以下反应混合物在分开的冷却的1.5mL管中制备:
   21μLH ₂ O
   6μL5x激酶反应缓冲液
   1μL放射性标记（"热"）ATP
   2μL底物（〜5 mg / mL）
   注意:对于重组激酶测定，可以调节体积以适应纯化的蛋白质。计算使最终反应体积为30μL。使用这个配方准备一个主人混合。在加入标记的ATP之前，将H ₂ O稀释至0.01mCi /μL的比活性，然后加入反应混合物中。
3. 为了初始化测定，将整个反应混合物加入激酶样品中，并根据测定的激酶的活性在30℃孵育5分钟至1小时。
   注意:当使用其活性尚未测定的激酶时，在时间点之间以5分钟间隔进行激酶活性的时间过程。

3.反应终止和SDS-PAGE

1. 放入冰上停止反应，并加入7.5μL5x Laemmli样品缓冲液⁶ 。
2. 在热块中在100℃下加热30秒至2分钟。
3. 在10-15％SDS-PAGE凝胶上，每孔接触20μL/孔。运行凝胶足够长以分离激酶和底物（通常在5 W的恒定功率下1小时）确保保持凝胶装置屏蔽以限制暴露于³² P上。
   1. 在这里，使用自制的凝胶装置，但标准的市售迷你凝胶是完全适合的。使用尺寸如下:
      凝胶:8厘米宽，5.5厘米长（分辨），1.5毫米厚度。
      梳子:15孔，1.5mm厚，2.9mm宽，16mm深

4.凝胶染色和干燥

注意:对于所有步骤，请务必使用放射性屏蔽和佩戴个人防护装备来减少³² P的个人暴露。有关具体步骤的更多信息，包括一些有用的参考。

1. 从玻璃/氧化铝平板上取出凝胶，并置于50毫升考马斯染色剂（10％冰醋酸，50％甲醇，0.25％R-250染料）中1小时。对于该步骤，使用比凝胶本身略大的容器。 ⁸
2. 将凝胶从染色剂移至定影液（10％冰醋酸）d，20％甲醇）以去污。将凝胶在600-700mL定影液中以50rpm在轨道振荡器上摇动过夜。将泡沫或打结的实验室擦拭物放在容器中，用凝胶吸收考马斯染料^8,9 。
3. 从固定溶液中取出凝胶，并在温和搅拌下浸泡在200 mL甲醇中1-2分钟，直到凝胶变成乳白色。这将有助于防止干燥步骤中的裂纹。
4. 用甲醇将14厘米x 14厘米的定性滤纸弄湿，放在平板凝胶真空干燥器上。将凝胶放在滤纸正面朝上。
5. 小心地用塑料盖住凝胶，以避免皱纹和气泡。在80℃下运行干燥器1.5小时。在真空得到打开盖子之后，如果需要的话，用软橡胶支架将所有的气泡推出。

放射自显影和闪烁计数

1. 清除dri并将凝胶上的滤纸上贴上自动标记，磷光标尺或点。如果使用点确保它们处于非对称模式。这将使曝光和显影后的凝胶与胶片保持一致。
2. 使用盖革计数器检查信号强度。对于较弱的信号，在-70°C至-80°C的强度屏幕曝光会增加胶片带密度。
3. 在黑暗的房间里，将干凝胶放置在胶片盒中，胶片和增强屏幕从上到下按顺序依次为:凝胶，薄膜，增强屏幕。
4. 将增强屏幕连接到盒子的盖子上，并将胶水贴在适当的位置，使此步骤更容易。当从32P的β粒子照射时，增强屏幕发光。这些光辐射比β粒子更有效地穿透膜。
   1. 确保从增强屏幕发出的波长相应池塘到电影最敏感的波长。
   2. 使用盖革计数器确定多长时间才能使用曝光:如果cpm计数为〜100或更低，请在-70°C下过夜。如果计数为〜10,000，则从1小时开始曝光并从那里进行优化。
5. 在曝光结束时，去除胶片并在医疗/ X光片处理器中发展。如果在-70至-80℃下进行曝光，则可以将盒子温热至室温，以尽量减少膜上的凝结，或者在冷凝液形成¹⁰之前立即取出膜。
6. 将膜放在干燥的凝胶/滤纸上，并将标记/点的图像与干燥凝胶上的标记/点对齐。在电影上标记对应于蛋白质标准的条带。标记蛋白质标准和哪些通道的反应是将来参考。
7. 从胶片中消除与胶片上感兴趣的条带相对应的胶带，并将其放置在7mL闪烁瓶中。加入4 mL闪烁液，用液体闪烁计数器计数。确认计数器设置为监视³² P的正确能谱窗口。
   注意:确保从无激酶对照泳道切除对应于底物的条带。这将用于计算将从所有样品闪烁计数中减去的背景辐射。

6.结果分析

注意:放射自显影图提供了结果的定性可视化。为了精确定量，可以用闪烁计数器测量³² P掺入。数据通常用相对活动来表示， 如图1B所示 。只要维持所有样品的均匀条件，比活度的相对测量就足以比较治疗。

1. 当计算绝对比活动值时，请执行严格的操作对所有反应条件（包括激酶，底物和冷ATP浓度）进行优化，以确保在一段时间过程中活性的线性范围（ 例如 2×[激酶] = 2×比活性）。对于具有高比活性的激酶，可以进行具有增加的底物浓度的测定，因为激酶活性受底物量的限制。
2. 以每分钟每mg激酶转移的磷酸纳米微粒单位计算感兴趣的激酶的比活性。
   1. 从计数带中的cpm中减去空白。
   2. 计算热ATP的衰减:[（1/2）^（t / t _1/2 ）] x 0.95其中t是参考日期以后的天数（应由供应商提供）， t _1/2是³² P的半衰期为14.3天，0.95反映了闪烁计数器的效率。示例:如果使用28天的热ATP，则衰减值应为0.245。
   3. 计算器测定中总ATP的皮摩尔（pmol）（通常等于反应中冷ATP的量）:测定体积（μL）×[冷ATP]（μM）=总ATP（pmols）。实施例:30μL×50μM= 1500pmol
   4. 计算cpm / pmol ATP:[热ATP x（2.2×10 ⁷ ）×衰变系数] / pmol的冷ATP。
      注意:2.2 x 10 ⁷的值将0.01 mCi /μL的ATP转换为cpm。
   5. 以mg计算测定中的激酶量。对于重组激酶和免疫沉淀的激酶，标准方法如BCA测定适用于测定起始浓度。实施例:在50μL激酶反应中，wtERK20.0002μg/μL为0.01μg，或1×10 ^-5 mg。
   6. 计算测定中的总cpm。组装30μL反应，每个反应在凝胶上运行20μL。将计数的cpm（空白减去后）乘以总测定体积/体积负载的因子。继续以上例如，将所有计数乘以1.5或30/20。
   7. 计算测定的激酶的比活性:
      测定中的总cpm）/（cpm / pmol ATP）/（测定时间（分钟））/（激酶的量，以mg计）
      注意:将上述值除以1,000，可得到纳摩尔/分/毫克的比活度
3. 计算多少摩尔磷酸盐掺入底物（只要其分子量已知）。一旦反应完成，这用于确定特定蛋白质上磷光体的数量。
   测定中的总cpm）/（cpm / pmol ATP）] /（pmols中的底物量）

结果

WNK1 IP激酶测定

将Myc标记的WNK1转染到HEK293细胞中，并用抗Myc抗体¹¹免疫沉淀。免疫沉淀物显示对模型底物MBP以及自身的激酶活性（ 图1A ）。然后通过相同的方法测试WNK1突变体对MBP的激酶活性，此时采用GST标记的构建体（ 图1B ）。相对于野生型的突变体激酶行为的分析揭示了对于最佳WNK...

讨论

激酶是一种多样化的蛋白质家族，其在多种情况下已经发展了广泛的功能，激酶测定在研究几种信号蛋白方面已经非常有用，并且极大地有助于我们目前对细胞通信的理解。值得注意的是，尽管在结构和活性上存在重大差异，但使用相同的基本测定来表征两种不同的激酶。 WNK1激酶含有非典型催化口袋，临界赖氨酸转移到独特的位置，已知通过激酶和脚手架功能调节阳离子氯化物共转运蛋白的作?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500