Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Резюме

Протеинкиназы представляют собой высокоразвитые сигнальные ферменты и каркасы, которые являются критическими для меж- и внутриклеточной передачи сигнала. Мы представляем протокол для измерения активности киназы с использованием радиоактивно меченого аденозинтрифосфата ([γ- ³² P] ATP), надежного метода, помогающего выявлять регуляцию клеточной сигнализации.

Аннотация

Протеинкиназы способны регулировать крупномасштабные клеточные изменения в ответ на сложные массивы раздражителей, и много усилий было направлено на выявление аллостерических деталей их регуляции. Киназы содержат сигнальные сети, дефекты которых часто являются признаками множественных форм рака и связанных с ними заболеваний, что делает платформу для анализа подходящей для манипулирования восходящими регуляторными факторами и валидации реакционных требований, критически важных для поиска улучшенных терапевтических средств. Здесь мы опишем базовый анализ киназы, который может быть легко адаптирован для удовлетворения конкретных экспериментальных вопросов, включая, но не ограничиваясь ими, тестирование эффектов биохимических и фармакологических агентов, генетических манипуляций, таких как мутация и делеция, а также условий культивирования клеток и методов лечения для зондирования Клеточные сигнальные механизмы. В этом анализе используется радиоактивно меченный [γ-32P] АТФ, который позволяет проводить количественные сравнения и четкую визуализацию результатов, и может быть модифицированнымДля использования с иммунопреципитированной или рекомбинантной киназой, специфическими или типизированными субстратами, во всем широком диапазоне условий реакции.

Введение

Протеинкиназы являются сложными ферментами, критичными для передачи клеточных сигналов в соответствующие реакции ¹ . Учитывая их роль в поддержании гомеостаза и предупреждении или развитии болезненных состояний ² , биохимические методы оценки активности киназы продолжают оставаться мощным инструментом для определения особенностей передачи сигналов эукариот ³ . Хотя стратегии, использующие фосфоспецифические антитела, были в высшей степени информативными с точки зрения измерения влияния различных условий лечения на статус ⁴ передачи сигнала в клетке, анализ киназы позволяет измерять эффекты различных условий лечения непосредственно в терминах ферментативной активности киназы интерес. Хотя существует несколько вариантов аналогичных анализов, которые не используют радиоактивные материалы ⁵ , мы по-прежнему полагаемся на этот метод для надежного количественного определения результатов. ТамЯвляются двумя типичными применениями этого анализа, которые являются ценными по различным причинам: анализ иммунопреципитата (IP) киназы ( рисунок 1 ) и анализ рекомбинантной протеинкиназы ( рисунок 2 ).

Анализ киназы IP чрезвычайно полезен для идентификации факторов, способных активировать специфические протеинкиназы, а также для оценки условий ингибирующего лечения. Вкратце, интересующую киназу эпитопа, представляющую интерес, трансфицируют в культивируемые эукариотические клетки, подвергают множеству обработок, иммунопреципитируют и анализируют на способность включать радиоактивно меченный фосфат в модельный субстрат ( например, основной миелиновый белок (MBP)). Анализ киназы IP также может быть выполнен без использования избыточной экспрессии либо путем иммунопреципитации эндогенного белка, либо с использованием любого количества методов редактирования генома. Поскольку лечение проводится в культуре, этот метод может обнаруживать стимуляции, передаваемые через множественные восходящие факторыИли параллельных путей путем считывания in vitro . Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он не требует предварительного знания прямых восходящих или нисходящих факторов или сайтов фосфорилирования в нем. Более того, как только определенные субстраты для представляющей интерес киназы были идентифицированы, такой же протокол анализа киназы может быть использован с рекомбинантными компонентами для измерения удельной активности в отношении природных субстратов и идентификации специфических сайтов фосфорилирования в сочетании с масс-спектрометрическим анализом. Сайты, идентифицированные таким образом, могут быть дополнительно подтверждены киназными анализами с использованием субстратных мутантов. Наконец, этот метод можно также использовать для обнаружения и измерения аутофосфорилирования.

Протокол, представленный здесь, предполагает либо оптимизированную схему очистки белка, либо способ трансфекции для экспрессии меченой сродства киназы, представляющей интерес в культивируемых клетках. Для более подробных описаний трансфекции, лизиса, иммунопреципитации и протеиновой очисткиОколей, мы предлагаем сослаться на протоколы Cold Spring Harbor ⁶ . Для получения дополнительной информации относительно разработки и модификации анализов, пожалуйста, обратитесь к Фосфорилированию белков: Избранные методы в энзимологии ⁷ .

протокол

1. Ресурсы для очистки киназы и общий контур иммунопреципитации

ПРИМЕЧАНИЕ. Киназы, используемые для этого анализа, могут быть получены из иммунопреципитатов культивируемых клеток или с помощью рекомбинантных средств, таких как очистка с аффинной меткой ⁶ . Ниже приведен общий протокол иммунопреципитации с меченым флагом, который, возможно, придется модифицировать в зависимости от интересующей киназы. Все должно быть на льду, когда это возможно.

1. Добавить 2 мкл 1 мг / мл антитела к 200 мкл клеточных лизатов (обычно ~ 1 мг / мл общей концентрации белка) и инкубировать при 4 ° С в течение 1 часа при качании.
2. Промывочный белок Сефарозные шарики 2-3 раза буфером для лизиса (см. Ниже) путем кратковременного прядения при 4 ° С в течение 30 с - 1 мин при 5000 мкг («касание спина»), удаления надосадочной жидкости с помощью пипетки и ресуспендирования гранул в буфере ,
   1. Готовят буфер для лизиса: 50 мМ HEPES pH 7,7, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂, 1 мМ ЭГТА, 10% глицерина, 0,2 мМ ортованадата натри, 100 мМ фторида натри, 50 мМ & beta; -глицерофосфата, 0,1% Тритона Х 100 или 0,1% NP-40.
3. Добавить 30 мкл 50% суспензии белковых сефарозных гранул в буфере для лизиса в лизаты; Инкубировать при 4 ° С в течение 1 часа при качании.
4. Прикоснитесь к вращению при 4 ° C для осаждения шариков и удаления надосадочной жидкости.
5. Промывают 3 раза с 1 мл буфера для промывки бусинок (1 М NaCl, 20 мМ Tris, рН 7,4).
6. Промывают один раз 1x киназным буфером для реакции (10 мМ HEPES pH 8,0, 10 мМ MgCl ₂ ). Удалите как можно больше буфера, не удаляя бусы.

2. Инициализация киназных реакций

ПРИМЕЧАНИЕ. Для анализов киназы IP, типичным исходным образцом является ~ 15 мкл нерастворенных гранул. Для анализов рекомбинантной протеинкиназы типичные исходные количества варьируют от 0,1 до 1,0 мкг в 1-10 для конечных объемов реакций 25-50 мкл. Отрегулируйте объемы образца рекомбинантного белкаS должны быть равны буферу, в котором они хранятся до инициализации анализа. При использовании больших количеств киназы, включают белок-носитель, такой как BSA, чтобы помочь в поддержании стабильности белка на время анализа.

1. Подготовьте 5x киназный реакционный буфер, приведенный ниже:
   50 мМ HEPES, рН 8,0
   50 мМ MgCl ₂
   50 мМ бензамидин (ингибитор протеазы)
   50 мМ DTT (восстановитель)
   250 мкМ АТФ (немеченое или «холодное»)
2. Держите образцы киназы на льду в пробирках по 1,5 мл. Готовят следующую реакционную смесь в отдельных охлажденных пробирках по 1,5 мл:
   21 мкл H ₂ O
   6 мкл 5x киназного реакционного буфера
   1 мкл радиоактивно меченного («горячего») АТФ
   2 мкл субстрата (~ 5 мг / мл)
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для анализов рекомбинантной киназы объем можно отрегулировать для размещения очищенного белка. Рассчитайте таким образом, чтобы конечный объем реакции составлял 30 мкл. Используйте этот рецепт, чтобы подготовить мастерсмешивание. После получения меченого АТФ разбавить запас в H ₂ O до удельной активности 0,01 мКи / мкл до добавления в реакционную смесь.
3. Для инициализации анализа добавьте всю реакционную смесь к образцу киназы и инкубируйте реакцию при 30 ° С в течение 5 мин-1 ч в зависимости от активности анализируемой киназы.
   ПРИМЕЧАНИЕ. При работе с киназой, активность которой ранее не анализировалась, проведите временной цикл активности киназы с интервалами 5 минут между временными точками.

3. Завершение реакции и SDS-PAGE

1. Остановите реакцию, добавив лед и добавив 7,5 мкл 5х буфера для образца Laemmli ⁶ .
2. Нагрейте при 100 ° C в течение 30 секунд до 2 минут в тепловом блоке.
3. Коснитесь спина и загрузите 20 мкл на лунку на 10-15% SDS-PAGE gel. Прогоните гель достаточно долго, чтобы отделить киназу и субстрат (обычно 1 час при постоянной мощности 5 Вт). Убедитесь, что гель-аппарат экранирован, чтобы ограничить воздействие ³² Р.
   1. Здесь используются самодельные гелевые аппараты, но стандартные коммерчески доступные мини-гели идеально подходят. Используйте размеры следующим образом:
      Гели: ширина 8 см, длина 5,5 см (разрешающая способность), толщина 1,5 мм.
      Комбс: 15 лунок, толщина 1,5 мм, ширина 2,9 мм, глубина 16 мм

4. Окрашивание и сушка геля

Внимание: на всех этапах обязательно снижайте личное облучение до ³² P с помощью радиоактивного экранирования и средств индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации о конкретных шагах, некоторые полезные ссылки включены.

1. Удалите гель из стеклянных / глиноземных пластин и поместите в 50 мл красителя Кумасси (10% ледяная уксусная кислота, 50% метанол, 0,25% краситель R-250) в течение 1 часа на орбитальном шейкере со скоростью 50 об / мин. Для этого шага используйте контейнер, который немного больше, чем сам гель. ⁸
2. Перенесите гель с пятна на фиксирующий раствор (10% ледяной уксусной кислотыГ, 20% метанола) для обесцвечивания. Наносите гель в 600-700 мл фиксирующего раствора в течение ночи на орбитальный шейкер со скоростью 50 об / мин. Поместите кусочки пены или сухие лабораторные салфетки в емкость с гелем для поглощения красителя Кумасси ^{8 , 9} .
3. Удалите гель из раствора для фиксации и впитайте в 200 мл метанола в течение 1-2 минут с легким перемешиванием до тех пор, пока гель не станет молочно-белым. Это поможет предотвратить растрескивание во время стадии сушки.
4. Смочите образец качественной фильтровальной бумаги 14 см х 14 см метанолом и положите на вакуумную сушку слябового геля. Положите гель на переднюю сторону фильтровальной бумаги вверх.
5. Накройте гель пластиковой пленкой тщательно, чтобы избежать появления морщин и пузырьков воздуха. Выполнить сушилку в течение 1,5 ч при 80 ° С. После того, как вакуум достигнут, откройте крышку и выкачайте любые пузырьки воздуха, если это необходимо, с мягкой резиной.

5. Авторадиограмма и сцинтилляционные подсчеты

1. Удалить driEd гель и прикрепить маркер autorad, фосфоресцентные правителя или точек на фильтровальной бумаге на стороне геля. Если используются точки, убедитесь, что они имеют асимметричный узор. Это позволит выровнять гель с пленкой после экспозиции и развития.
2. Используйте счетчик Гейгера, чтобы проверить интенсивность сигнала. Для более слабых сигналов при -70 ° C до -80 ° C с усиливающим экраном повышается плотность пленочной ленты.
3. В темной комнате поместите высушенный гель в кассету с пленкой и усиленный экран в следующем порядке сверху вниз: гель, пленка, усиливающий экран.
4. Прикрепите усиливающий экран к крышке кассеты и заклейте гель на место, чтобы сделать этот шаг легче. Усиливающий экран излучает свет при облучении бета-частицами из ³² P. Эти световые излучения проникают в пленку более эффективно, чем бета-частицы.
   1. Удостоверьтесь, что длина волны, испускаемая от усиливающего экрана corresПруды с длиной волны, к которой пленка наиболее чувствительна.
   2. Используйте счетчик Гейгера, чтобы определить, на какое время оставить воздействие: если число отсчетов в минуту составляет ~ 100 или ниже, попробуйте в течение ночи при -70 ° C. Если количество отсчетов составляет ~ 10000, начните с экспозиции 1 час и оптимизируйте оттуда.
5. По завершении экспозиции удалите пленку и разработайте в медицинском / рентгеновском пленочном процессоре. Если экспозиция была выполнена при температуре от -70 до -80 ° C, либо дайте кассете нагреться до комнатной температуры, чтобы минимизировать конденсацию на пленке, либо удалить пленку непосредственно перед образованием конденсата ¹⁰ .
6. Положите пленку на высушенную гелевую / фильтровальную бумагу и выровняйте изображение метки / точек маркерами / точками на высушенном геле. Отметьте на пленке полосы, соответствующие стандартам белка. Пометьте стандарты белков, и какие полосы реакций предназначены для использования в будущем.
7. Извлеките полосы из геля, которые соответствуют полосам интереса к фильму, и поместите ихВ 7 мл сцинтилляционных флаконов. Добавьте 4 мл сцинтилляционной жидкости и подсчитайте с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Подтвердите, что счетчик установлен для контроля правильного окна энергетического спектра на ³² P.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно также вырезать полосу, соответствующую субстрату, из полосы контроля отсутствия киназы. Это будет использоваться для расчета фонового излучения, которое будет вычитаться из всех отсчетов сцинтилляции образца.

6. Анализ результатов

ПРИМЕЧАНИЕ. Авторадиограмма обеспечивает качественную визуализацию результатов. Для точного количественного определения включение ³² P можно измерить с помощью сцинтилляционного счетчика. Данные обычно выражаются в относительной активности, как показано на рисунке 1B . Пока для всех образцов поддерживаются одинаковые условия, относительных измерений удельной активности достаточно для сравнения обработок.

1. При расчете абсолютных значений удельной активности выполняйте строгостьОптимизация всех условий реакции, включая концентрацию киназы, субстрата и холода АТФ, для обеспечения линейного диапазона активности во времени ( например, 2 x киназа = 2 x удельная активность). Для киназ с высокой удельной активностью проводят анализы с повышенной концентрацией субстрата в случае, если активность киназы ограничена количеством субстрата.
2. Рассчитать удельную активность интересующей киназы в единицах наномолей фосфата, переносимых в минуту на мг киназы.
   1. Вычитайте пробелы из cpm в подсчитанных диапазонах.
   2. Рассчитайте распад горячего ATP: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0.95, где t - количество дней с контрольной даты (должно быть предоставлено поставщиком), t _1/2 - Период полураспада ³² Р, что составляет 14,3 дня, а 0,95 отражает эффективность сцинтилляционного счетчика. Пример: при использовании горячего ATP, который составляет 28 дней, значение распада должно быть 0.245.
   3. Calc(Обычно это равно количеству холодного АТФ в реакции): объем анализа (мкл) х [холодный АТФ] (мкМ) = общий АТР (пмоль). Пример: 30 мкл × 50 мкМ = 1500 пмоль
   4. Вычислить cpm / pmol ATP: [мкл горячего ATP x (2,2 × 10 ⁷ ) × коэффициент распада] / пмоль холодного АТФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Значение 2,2 × 10 ⁷ преобразует 0,01 мКи / мкл АТФ в cpm.
   5. Рассчитать количество киназы в анализе в мг. Как для рекомбинантной киназы, так и для иммунопреципитированных киназ стандартные методы, такие как анализы BCA, подходят для определения исходных концентраций. Пример: wtERK2 0,0002 мкг / мкл в 50 мкл киназной реакции составляет 0,01 мкг или 1 × 10 ^-5 мг.
   6. Рассчитайте общее количество cpm в анализе. Соберите 30 мкл реакций и запустить 20 мкл от каждой реакции на гель. Умножьте отсчет cpm (после пустого вычитания) коэффициентом суммарного объема анализа / объема. Продолжая вышеупомянутоеНапример, умножьте все значения на 1,5 или 30/20.
   7. Рассчитайте удельную активность анализируемой киназы:
      Общее количество cpm в анализе) / (cpm / pmol ATP) / (время анализа в минутах) / (количество киназы в мг)
      ПРИМЕЧАНИЕ. Разделение вышеуказанного значения на 1000 дает удельную активность в наномолях / минуту / мг
3. Вычислите, сколько молей фосфата включено в субстрат (если известен его молекулярный вес). Это используется для определения количества фосфозитов на конкретном белке после завершения реакции.
   Общее количество cpm в анализе) / (cpm / pmol ATP)] / (количество субстрата в пмоль)

Результаты

Анализы киназы IP WNK1

Myc-меченный WNK1 трансфицировали в клетки HEK293 и иммунопреципитировали антителом против Myc11. Иммунопреципитат проявлял киназную активность по отношению к модельному субстрату МВР, а также к себе ( рисунок 1А ). З...

Обсуждение

Киназы представляют собой разнообразное семейство белков, которые развили обширную функциональность в многочисленных контекстах, и киназные анализы были невероятно полезны при изучении нескольких сигнальных белков и в значительной степени способствовали нашему текущему пониманию...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500