Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Özet

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- ³² P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Özet

Protein kinazlar, kompleks uyarı dizilerine yanıt olarak büyük ölçekli hücresel değişiklikleri yönetebilir ve düzenlemelerinin allosterik ayrıntılarını açığa çıkarmak için çok çaba harcanmıştır. Kinazlar, kusurları çoğunlukla birden fazla kanser türü ve ilgili hastalıkların özelliklerini gösteren işaret şebekelerini içerir ve bu sayede iyileştirici terapötik araştırmalarında kritik olan reaksiyon gereksinimlerinin geçerliliği için bir analiz platformu oluşturulabilir. Burada, biyokimyasal ve farmakolojik ajanlar, mutasyon ve silme gibi genetik manipülasyonların yanı sıra hücre kültürü koşulları ve problara uygulanan tedavilerin testleri de dahil ancak bunlarla sınırlı olmayan spesifik deneysel sorulara uyacak şekilde kolayca adapte edilebilen basit bir kinaz testini açıkladık Hücre sinyal mekanizmaları. Bu tahlil, niceliksel karşılaştırmalara ve sonuçların net görselleştirilmesine imkan tanıyan radyoaktif işaretlenmiş [γ- ³² P] ATP'yi kullanır ve mod olabilirImmüno-çökeltilmiş veya rekombinan kinaz, spesifik veya tipik substratlar ile birlikte kullanım için geniş bir yelpazede reaksiyon koşullarına sahiptir.

Giriş

Protein kinazlar, hücresel sinyallerin uygun cevaplara iletilmesi için kritik olan sofistike enzimlerdir ¹ . Homeostazın korunması ve hastalık durumlarının önlenmesi veya yükseltilmesindeki rolleri göz önüne alındığında, kinaz aktivitesini değerlendirmeye yönelik biyokimyasal yöntemler, ökaryotik işaretlemenin ayrıntılarını açıklamak için güçlü araçlar olmaya devam etmektedir ³ . Fosfoya özgü antikorları kullanan stratejiler, farklı tedavi koşullarının hücre sinyal durumu ⁴ üzerindeki etkilerini ölçmek açısından son derece bilgilendirici olmasına rağmen, bir kinaz tahlili, farklı tedavi koşullarının doğrudan bir kinaz enzim aktivitesi açısından ölçülmesini sağlar. faiz. Benzer tahliller için radyoaktif materyal 5'i kullanmayan çeşitli seçenekler olsa da, sonuçların sağlıklı bir şekilde ölçülmesi için bu metoda güveniyoruz. Orada, Bu tahlilin, farklı nedenlerle değerli olan iki tipik uygulamasıdır: immüno çökeltilmiş (IP) kinaz tahlili ( Şekil 1 ) ve rekombinant protein kinaz tahlili ( Şekil 2 ).

IP kinaz tahlili, spesifik protein kinazları aktive edebilen faktörleri tanımlamak ve inhibe edici tedavi koşullarını belirlemek için çok yararlıdır. Kısaca, ilgilenilen bir epitopla etiketlenmiş kinaz kültürlenmiş ökaryotik hücrelere aktarılır, çeşitli tedavilere tabi tutulur, immüno-çökeltilir ve radyoaktif işaretlenmiş fosfatın bir model substrata ( örn., Miyelin bazik protein (MBP)) dahil edilme yeteneği açısından denenmiştir. IP kinaz tahlili, endojen proteinin immüno-çökmesi veya herhangi sayıda genom düzenleme tekniği ile aşırı ekspresyona başvurmadan da yapılabilir. Tedaviler kültüre uygulandığından, bu yöntem çok sayıda yukarı akış faktörü aracılığıyla iletilen uyarıları tespit edebilirVeya paralel yolaklarda in vitro okuma yoluyla. Bu yöntemin en önemli bir avantajı, direkt yukarı akış veya aşağı akış faktörlerine veya fosforilasyon bölgelerine ilişkin önceden bilgi gerektirmediğidir. Dahası, ilgilenilen bir kinaz için spesifik substratlar belirlendikten sonra, aynı kinaz tahlil protokolü, doğal substratlara karşı spesifik aktiviteyi ölçmek ve rekombinant bileşenlerle birlikte kütle spektrometresi analizi ile birleştirildiğinde spesifik fosforilasyon yerlerini belirlemek için kullanılabilir. Bu şekilde tanımlanan bölgeler, substrat mutantlarını kullanan kinaz tahlilleriyle daha da doğrulanabilir. Son olarak, bu yöntem otofosforilasyonu saptamak ve ölçmek için de kullanılabilir.

Burada verilen protokol, kültürlenmiş hücrelerde ilgi çekici bir etiketlenmiş kinazın ekspresyonu için optimize edilmiş bir protein saflaştırma şeması veya transfeksiyon yöntemi varsayar. Transfeksiyon, lizis, immüno çökeltme ve protein saflaştırma protokolünün daha ayrıntılı sergilenmesi içinOcols, Cold Spring Harbor Protocols ^6'ya atfen öneriyoruz. Test geliştirme ve modifikasyonu hakkında daha fazla bilgi için, Protein Fosforilasyonu: Enzimolojide Seçilmiş Yöntemler ^{7'ye bakın} .

Protokol

1. Kinaz Saflaştırma Kaynakları ve Genel İmmünopresipitasyon Boru Hattı

NOT: Bu testle birlikte kullanılacak kinazlar, kültürlenmiş hücrelerin immüno çöktürmelerinden veya afinite etiketli saflaştırma gibi rekombinant vasıtalarla elde edilebilir ⁶ . Aşağıda, ilgilenilen kinaza bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilecek bayrak etiketli immüno çökeltme için genel bir protokol bulunmaktadır. Mümkün olduğunca her şey buz üzerinde tutulmalıdır.

1. Salgılanırken hücre lizatlarının 200 μL'sine (genellikle ~ 1 mg / mL toplam protein konsantrasyon) 2 μL 1 mg / mL antikor ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
2. Protein A sefaroz boncuklarını lizis tamponu ile yıkayın (aşağıya bakın), 5,000 xg'de ("dokunmatik sıkma") 30 saniye ila 1 dakika süreyle 4 ° C'de kısaca döndürünüz, bir pipet ile süpernatantı çıkarıp, tamponda boncuklar yeniden süspansiyon haline getirerek .
   1. Lizis tamponu hazırlayın: 50 mM HEPES pH 7.7, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 10 gliserol, 0.2 mM sodyum ortovanadat, 100 mM sodyum florür, 50 mM β-gliserofosfat,% 0.1 Triton X 100 veya% 0.1 NP-40.
3. Lizis tamponundaki lisinatlara protein A sefaroz boncuklarının% 50 bulamaçından 30 uL ekleyin; Sallanırken 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
4. Boncukları pelet haline getirmek ve süpernatanı çıkarmak için 4 ° C'de döndürmeye dokunun.
5. 3 kez 1 mL boncuk yıkama tamponu (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) ile yıkayın.
6. Bir kere 1x kinaz reaksiyon tamponu (10 mM HEPES pH 8.0, 10 mM MgCl2) ile yıkayın. Boncukları çıkarmadan mümkün olduğunca fazla tampon çıkarın.

2. Kinaz Tepkimelerinin Başlatılması

NOT: IP kinaz tahlillerinde, ~ 15 μL susuz boncuklar tipik bir başlangıç ​​örneğidir. Rekombinant protein kinaz tahlilleri için, tipik başlangıç ​​miktarları 25-50 uL'lik nihai reaksiyon hacimleri için 1-10,1-1,0 μg aralığında değişir. Rekombinant protein örneğinin hacimlerini ayarlayınS, tayini başlatmadan önce saklanan tampona eşit olmalıdır. Yüksek miktarda kinaz kullanırken, test süresince protein stabilitesinin korunmasına yardımcı olmak için BSA gibi bir taşıyıcı protein ekleyin.

1. Aşağıda verilen 5x kinaz reaksiyon tamponunu hazırlayın:
   50 mM HEPES pH 8.0
   50 mM MgCI2
   50 mM Benzamidin (proteaz inhibitörü)
   50 mM DTT (redüksiyon ajanı)
   250 uM ATP (etiketsiz veya "soğuk")
2. 1.5 mL tüpler içinde buz üzerinde kinaz örnekleri tutun. Aşağıdaki reaksiyon karışımını ayrı, soğutulmuş 1.5 mL tüplerde hazırlayın:
   21 uL H20
   6 uL 5x kinaz reaksiyon tamponu
   1 μL radyoaktif işaretlenmiş ("sıcak") ATP
   2 uL substrat (~ 5 mg / mL)
   NOT: Rekombinant kinaz tahlillerinde, hacim saflaştırılmış proteine ​​uyacak şekilde ayarlanabilir. Nihai reaksiyon hacmi 30 mcL olacak şekilde hesaplayın. Bir tarifi hazırlamak için bu tarifi kullanınkarıştırın. Etiketli ATP'nin alınması üzerine, tepkime karışımına ilave edilmeden önce H20'da 0.01 mCi / μL'lik spesifik bir aktiviteye seyreltilmiş stok.
3. Testi başlatmak için, reaksiyon karışımının tamamını kinaz numunesine ekleyin ve reaksiyona giren kinazın aktivitesine bağlı olarak 30 ° C'de 5 dakika ila 1 saat reaksiyon inkübe edin.
   NOT: Etkinliği önceden test edilmemiş olan bir kinaz ile çalışırken, zaman noktaları arasında 5 dakika aralıklarla bir süre kinaz aktivitesi gerçekleştirin.

3. Reaksiyon Sonlandırma ve SDS-PAGE

1. Buz koyarak ve 7.5 uL 5x Laemmli numune tamponu ⁶ ilave ederek reaksiyonu durdurun.
2. Isı bloğunda 30 saniye ila 2 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtın.
3. Dokunmaya basın ve% 10-15 SDS-PAGE jelinde oyuk başına 20 mcL yükleyin. Kinazı ve alt tabakayı ayırmak için yeterince uzun süre jel edin (normalde 5 W sabit gücünde 1 saat) Jel ​​aygıtı, ^32'ye maruz kalma oranını sınırlandırmak için korumalı olduğundan emin olun. p.
   1. Burada, ev yapımı jel aparatlarını kullanın, ancak piyasada bulunan standart mini jeller kusursuz bir şekilde uygundur. Boyutları aşağıdaki gibi kullanın:
      Jeller: 8 cm genişlik, 5.5 cm uzunluk (özünürlük), 1.5 mm kalınlık.
      Taraklar: 15 oyuk, 1,5 mm kalınlık, 2,9 mm genişlik, 16 mm derinlik

4. Jel boyama ve kurutma

Dikkat: Tüm basamaklarda, radyoaktif ekran kullanan ve kişisel koruyucu ekipman giyerek kişisel maruziyeti ³² P'ye düşürdüğünüzden emin olun. Belirli adımlarla ilgili daha fazla bilgi için bazı yararlı referanslar bulunmaktadır.

1. Jel cam / alumina plakalarından çıkarılır ve 50 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 saat süreyle 50 mL Coomassie lekesi (% 10 glasiyal asetik asit,% 50 metanol,% 0.25 R-250 boya) yerleştirilir. Bu adım için, jelden biraz daha büyük bir kap kullanın. ⁸
2. Jeli lekeden sabitleme solüsyonuna (% 10 buzlu asetik asitD,% 20 metanol) de leke giderildi. Gece 50 rpm'de orbital çalkalayıcıda 600-700 mL sabitleme solüsyonunda jel salınır. Coomassie boya ^{8 , 9} emmek için köpük parçaları veya düğümlü laboratuar mendilleri jel ile kaba yerleştirin.
3. Sabitleme çözeltisinden jel çıkarın ve jöle sarımsı beyaza dönene dek 1-2 dakika hafifçe karıştırarak 200 mL metanol içine batın. Bu kurutma işlemi sırasında çatlamayı önlemeye yardımcı olacaktır.
4. Metanol ile kalitatif bir filtre kağıdı 14 cm x 14 cm'lik bir parça ıslatın ve kütük jel vakumlu kurutucuya yerleştirin. Jelin filtre kağıdının ön tarafı yukarı bakacak şekilde bırakın.
5. Kırışıklıkların ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için jel plastik ambalajla dikkatle örtülmelidir. Kurutucuyu 80 ° C'de 1.5 saat çalıştırın. Vakum elde edildikten sonra kapağı açın ve gerekirse herhangi bir hava kabarcıklarını yumuşak bir kauçuk köpük ile püskürtün.

5. Otoradyogram ve Sintilasyon Sayıları

1. Dri'yi kaldırJelin kenarındaki filtre kağıdına bir autorad markörü, fotoselli cetvel veya noktalar ekleyin. Nokta kullanılıyorsa bunların asimetrik bir biçimde olduğundan emin olun. Bu, pozlamadan ve geliştirildikten sonra jel ile filmi hizalayacaktır.
2. Sinyal yoğunluğunu kontrol etmek için Geiger sayacı kullanın. Zayıf sinyaller için yoğunlaşan bir ekranla -70 ° C ila -80 ° C arasındaki pozlama film band yoğunluğunu artıracaktır.
3. Karanlık bir odada kurutulmuş jel, filmle birlikte bir film kasetine, üstten alta doğru yoğunlaşan bir ekrana yerleştirin: jel, film, yoğunlaştırıcı ekran.
4. Yoğunlaştırma ekranını kasetin kapağına takın ve bu adımı kolaylaştırmak için jeli bantlayın. Yoğunlaştıran ekran, ³² P'den gelen beta partikülleri tarafından ışınlandığında ışık yayar. Bu ışık emisyonları, filmi beta partiküllerinden daha verimli şekilde geçirir.
   1. Yoğunlaştırıcı ekranın yaydığı dalga boyununGölet filmi en hassas dalga boyuna kadar.
   2. Maruz kalmanın ne kadar süreceğini belirlemek için Geiger sayacı kullanın: cpm sayısı ~ 100 veya daha düşükse, gece boyunca -70 ° C'de deneyin. Sayım ~ 10.000 ise, 1 saat pozlama ile başlayın ve oradan optimize edin.
5. Pozlamanın sonunda filmi çıkarın ve bir tıbbi / X-ışını film işlemcisinde gelişir. Pozlama -70 ila -80 ° C arasında gerçekleştirildiyse, film üzerindeki yoğunlaşmayı en aza indirgemek için yoğunlaştırma oluşmadan hemen önce kaseti oda sıcaklığına getirmesine izin verin ¹⁰ .
6. Filmi kurutulmuş jel / filtre kağıdı üzerine yerleştirin ve işaretli / noktalı görüntüleri kurutulmuş jel üzerindeki işaretleyiciler / noktalar ile hizalayın. Filmde protein standartlarına karşılık gelen bantları işaretleyin. Protein standartlarını ve reaksiyonların gelecekteki referanslar için hangi hatları etiketleyin.
7. Filmdeki ilgi bantlarına karşılık gelen bantları jelden ayırın ve onları yerleştirin7 mL sintilasyon flakonlarında. 4 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve sıvı sintilasyon sayacı ile sayın. Sayıcının, ³² P için doğru enerji spektrum penceresini izleyecek şekilde ayarlandığını teyit edin.
   NOT: Ayrıca, no-kinase kontrol şeridinden substrata karşılık gelen bandı çıkardığınızdan emin olun. Bu, tüm numune sintilasyon sayımlarından çıkarılacak olan arka plan radyasyonunun hesaplanması için kullanılacaktır.

6. Sonuçların Analizi

NOT: Otoradyogram, sonuçların niteliksel olarak görselleştirilmesini sağlar. Doğru kantitasyon için, bir sintilasyon sayacı ile ³² P birleşmesi ölçülebilir. Veriler, Şekil 1B'de gösterildiği gibi, genellikle göreceli etkinlik açısından ifade edilir. Tüm numuneler için muntazam koşullar sağlandığı sürece, spesifik aktivitenin göreceli ölçümleri, tedavileri karşılaştırmak için yeterlidir.

1. Mutlak spesifik aktivite değerlerini hesaplarken bir sertlik gerçekleştirinBir süre boyunca ( örn., 2 x [kinaz] = 2 x spesifik aktivite) lineer bir aktivite aralığı sağlamak için, kinaz, substrat ve soğuk ATP konsantrasyonları dahil tüm reaksiyon koşullarının optimizasyonu. Yüksek spesifik aktiviteye sahip kinazlar için, kinaz aktivitesinin substrat miktarı ile sınırlanması durumunda artırılmış substrat konsantrasyonu ile tahliller yapın.
2. Mg kinaz başına dakikada aktarılan nanomole fosfat birimleri cinsinden ilgili kinazın spesifik aktivitesini hesaplayın.
   1. Sayılmış bantlardaki boşlukları cpm'den çıkarın.
   2. Sıcak ATP'nin bozunumunu hesaplayın: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0.95 Burada t referans tarihinden bu yana geçen gün sayısıdır (satıcı tarafından sağlanmalıdır), t _1/2 , Yarılanma ömrü ³² P olan 14.3 gün ve 0.95, sintilasyon sayacının verimliliğini yansıtıyor. Örnek: 28 günlük sıcak ATP kullanılıyorsa, bozunma değeri 0.245 olmalıdır.
   3. CalcTahlil hacmi (μL) x [soğuk ATP] (μM) = toplam ATP (pmol): toplam ATP'nin pikomollerini (pmol) tahlilde ölçün (genellikle reaksiyondaki soğuk ATP miktarına eşittir). Örnek: 30 uL x 50 uM = 1500 pmol
   4. Cpm / pmol ATP'yi hesaplayın: [sıcak ATP x μL (2.2 x 10 ⁷ ) x bozunma faktörü] / pmol soğuk ATP.
      NOT: 2,2 x 10 ⁷ değeri 0.01 mCi / μL ATP'yi cpm'ye dönüştürür.
   5. Deneydeki kinaz miktarını mg cinsinden hesaplayın. Hem rekombinant kinaz hem de immüno-çökeltilmiş kinazlar için başlangıç ​​konsantrasyonlarının belirlenmesinde BCA tahlilleri gibi standart metotlar uygundur. Örnek: 50 μL kinaz reaksiyonunda wtERK2 0.0002 μg / μL, 0.01 μg veya 1 x ^10-5 mg'dir.
   6. Testte toplam cpm'yi hesaplayın. 30 μL reaksiyonları monte edin ve her reaksiyondan bir jel üzerinde 20 μL çalıştırın. Sayılan toplamı (boş çıkarma sonrasında) yüklenen toplam tahlil hacmi / hacmi faktörüne çarpın. Yukarıdakilere devam etmekÖrneğin, tüm sayıları 1,5 ya da 30/20 ile çarpın.
   7. Test edilen kinazın spesifik aktivitesini hesaplayın:
      Deneyde toplam cpm) / (cpm / pmol ATP) / (tahlil süresi dakika olarak) / (kinaz miktarı mg cinsinden)
      NOT: Yukarıdaki değeri 1.000'e bölmek, spesifik aktiviteyi nanomole / dakika / mg cinsinden verir
3. Bir substrata kaç molekül fosfat eklendiğini hesaplayın (molekül ağırlığı biliniyorsa). Bu, reaksiyon tamamlandıktan sonra belirli bir proteindeki fosfosit sayısını belirlemek için kullanılır.
   Deneyde toplam cpm) / (cpm / pmol ATP)] / (pmol cinsinden alt tabaka miktarı)

Sonuçlar

WNK1 IP kinaz tahlilleri

Myc etiketli WNK1, HEK293 hücrelerine transfekte edildi ve bir anti-Myc antikoru ¹¹ ile immüno-çökeltildi. İmmünopresipitat model substrat MBP'ye ve kendisine doğru kinaz aktivitesini göstermiştir ( Şekil 1A ). Daha sonra WNK1 mutantları aynı usulle MBP'ye karşı kinaz aktivitesi için test edildi, bu kez GST etiketli yapılar kullanıldı (

Tartışmalar

Kinazlar sayısız bağlamda kapsamlı işlevsellik geliştirdiler proteinlerin bir ailesidir ve kinaz tahlilleri birkaç sinyal protein incelenmesi için inanılmaz faydalı olmuştur ve hücresel iletişim mevcut mevcut anlayışımıza büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Özellikle yapı ve aktivitede büyük farklılıklara rağmen iki farklı kinazın karakterizasyonunda aynı temel tahliller kullanılmıştır. WNK1 kinazı, kritik lizin eşsiz bir konuma kaymış ve hem kinaz hem de iskele işlevleri yoluyla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500