방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

요약

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- ³² P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

초록

단백질 키나아제는 복잡한 자극 배열에 반응하여 대규모 세포 변화를 조절할 수 있으며, 조절에 대한 알로 스테 릭 세부 사항을 밝히기 위해 많은 노력이 기울여왔다. 키나아제는 결함이 종종 여러 형태의 암 및 관련 질병의 특징 인 신호 전달 네트워크를 포함하여 상향 조절 인자의 조작 및 개선 된 치료법을 찾는 데 필수적인 반응 요구 사항의 확인에 적합한 분석 플랫폼을 만든다. 여기서 우리는 생화학 및 약리학 적 약제의 영향, 돌연변이 및 결실과 같은 유전 조작, 세포 배양 조건 및 프로브에 대한 처리를 시험하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 실험 문제에 쉽게 적응할 수있는 기본적인 키나아제 분석을 기술한다 세포 신호 메커니즘. 이 분석법은 방사성 표지 된 [γ- ³² P] ATP를 사용하여 정량적 비교와 결과의 명확한 가시화가 가능하며 mod광범위한 반응 조건에 걸쳐 면역 침전 또는 재조합 키나아제, 특이 적 또는 전형적 기질과 함께 사용하기에 적합하다.

서문

단백질 키나아제는 세포 신호를 적절한 반응으로 전달하는 데 중요한 정교한 효소입니다 ¹ . 항상성 유지와 질병 상태의 예방 또는 증진에있어 역할을 감안할 때, 키나아제 활성을 평가하는 생화학 적 방법은 진핵 세포 신호 전달의 세부 사항을 묘사하기위한 강력한 도구가되고있다. 포스 포 - 특이 적 항체를 이용하는 전략이 세포 신호 상태 ⁴ 에 대한 상이한 처리 조건의 영향을 측정하는 관점에서 매우 유익 하였지만, 키나아제 분석은 상이한 처리 조건의 영향을 직접적으로 다른 키나아제의 효소 활성의 관점에서 측정 할 수있게한다 관심. 방사성 물질을 사용하지 않는 유사한 분석법에 대한 몇 가지 옵션이 있지만, 우리는 결과의 견고한 정량화를 위해이 방법을 계속 사용합니다. 그곳에면역 침전 된 (IP) 키나아제 분석 ( 그림 1 )과 재조합 단백질 키나아제 ( 그림 2 )의 두 가지 일반적인 용도로 사용됩니다.

IP 키니 아제 분석은 특정 단백질 키나아제를 활성화 할 수있는 요인을 확인하고 측정 억제 조건을 측정하는 데 매우 유용합니다. 간단히 말하면, 관심있는 에피토프 - 표지 된 키나아제를 배양 된 진핵 세포에 형질 감염시키고, 다양한 처리를 실시하고, 면역 침강시키고, 방사성 표지 된 인산염을 모델 기질 ( 예를 들어, 미엘린 염기성 단백질 (MBP))에 혼입시키는 능력에 대해 분석한다. IP 키나아제 분석은 또한 내인성 단백질의 면역 침전 또는 임의의 수의 게놈 편집 기술에 의한 과발현에 의하지 않고 수행 될 수있다. 처리가 배양 물에서 수행되기 때문에,이 방법은 다수의 상류 인자를 통해 전달 된 자극을 검출 할 수있다또는 평행 경로 에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 한 가지 주요 이점은 직접 상류 ​​또는 하류의 인자 또는 인산화 부위에 대한 사전 지식이 필요 없다는 것이다. 또한 관심 키나아제에 대한 특정 기질이 확인되면 동일한 키나아제 분석 프로토콜을 재조합 성분과 함께 사용하여 천연 기질에 대한 특정 활성을 측정하고 질량 분석기와 결합 할 때 특정 인산화 부위를 식별 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 동정 된 부위는 기질 돌연변이 체를 이용하는 키나아제 검정으로 더 검증 될 수있다. 마지막으로,이 방법은 또한자가 인산화를 검출하고 측정하는데 사용될 수있다.

여기서 제공된 프로토콜은 배양 된 세포에서 관심있는 친 화성 태그 키나아제를 발현하기위한 최적화 된 단백질 정제 방법 또는 형질 감염 방법을 가정한다. 형질 감염, 용해, 면역 침전 및 단백질 정제에 대한보다 자세한 설명은ocols, 우리는 콜드 스프링 하버 프로토콜 ⁶ 을 추천하는 것이 좋습니다. 분석법 개발 및 변형에 관한 더 자세한 정보는 단백질 인산화 : 효소학의 선정 된 방법 ⁷ 을 참조하십시오.

프로토콜

1. 키나아제 정제 자원 및 일반 면역 침전 파이프 라인

참고 :이 분석과 함께 사용하기위한 키나제는 교양 세포의 immunoprecipitates 또는 친화력 태그 정제 ⁶ 와 같은 재조합 수단에 의해 공급 수 있습니다. 다음은 관심 키나아제에 따라 변형 될 수있는 flag-tagged immunoprecipitation에 대한 일반적인 프로토콜입니다. 가능한 모든 것은 얼음에 보관해야합니다.

1. 락 할 동안 세포 용 해물 200 μL에 1 mg / mL 항체 2 μL (일반적으로 ~ 1 mg / mL 총 단백질 농도)를 첨가하고 4 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
2. 단백질 A 세파 로즈 비즈를 4 ℃에서 짧게 회전하여 5000 xg ( "터치 스핀")에서 1 분간 1 분간 방치하여 용해 완충액 (아래 참조)으로 2 ~ 3 회 세척하고 피펫으로 상등액을 제거하고 완충액에 비즈를 resuspending .
   1. 용해 버퍼 준비 : 50 MM HEPES 산도 7.7, 150 MM NaCl, 1.5 MM MgCl ₂, 1 mM EGTA, 10 % 글리세롤, 0.2 mM 나트륨 오르토 바나 데이트, 100 mM 플루오르 화 나트륨, 50 mM β- 글리세로 포스페이트, 0.1 % 트리톤 X 100 또는 0.1 % NP-40.
3. lysates에 용해 버퍼에 단백질 A sepharose 구슬의 50 % 슬러리 30 μL를 추가합니다; 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하면서 흔들어 준다.
4. 4 ° C에서 스핀을 터치하여 비드를 펠렛 화하고 상층 액을 제거합니다.
5. 비드 세척 완충액 (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) 1 mL로 3 번 씻는다.
6. 1X 키나제 반응 완충액 (10mM HEPES pH 8.0, 10mM MgCl ₂ )으로 1 회 씻는다. 구슬을 제거하지 않고 가능한 많은 버퍼를 제거하십시오.

2. 키니 아제 반응의 초기화

참고 : IP 키나제 검사의 경우, 일시 중지되지 않은 비드 ~ 15 μL가 일반적인 시작 시료입니다. 재조합 단백질 키나아제 분석의 경우, 일반적인 시작 량은 최종 반응 부피 25-50 μL에 대해 1-10에서 0.1-1.0 μg 범위입니다. 재조합 단백질 시료의 부피 조절s는 분석을 초기화하기 전에 저장되는 버퍼와 동일해야합니다. 대량의 키나아제를 사용하는 경우 분석 기간 동안 단백질 안정성을 유지하는 데 도움이되는 BSA와 같은 담체 단백질을 포함하십시오.

1. 아래에 주어진 5x 키나아제 반응 버퍼를 준비하십시오 :
   50 mM HEPES pH 8.0
   50 mM MgCl2
   50 mM 벤 자미 딘 (프로테아제 억제제)
   50 mM DTT (환원제)
   250 μM ATP (레이블이 지정되지 않았거나 "저온")
2. 키나아제 샘플을 1.5 mL 튜브에 얼음에 보관하십시오. 별도의 냉각 된 1.5 mL 튜브에서 다음 반응 혼합물을 조제하십시오 :
   H ₂ O 21 μL
   6 μL 5x 키나아제 반응 완충액
   1 μL 방사성 표지 ( "핫") ATP
   2 μL 기질 (~ 5 mg / mL)
   참고 : 재조합 키나아제 분석의 경우, 정제 된 단백질을 수용하기 위해 부피를 조절할 수 있습니다. 최종 반응 부피가 30 μL가되도록 계산한다. 이 조리법을 사용하여 마스터 준비혼합. 표지 된 ATP를 받으면 반응 혼합물에 첨가하기 전에 0.01 Mci / μL의 비 활동으로 H2O의 원료를 희석한다.
3. 분석을 초기화하려면 전체 반응 혼합물을 키나제 샘플에 첨가하고 분석 할 키나아제 활성에 따라 30 분에서 1 분간 5 분간 반응을 일으킨다.
   참고 : 이전에 활성을 측정하지 않은 키나아제로 작업 할 때는 시간 간격 사이에 5 분 간격으로 키나아제 활동의 시간 경과를 수행하십시오.

3. 반응 종결 및 SDS-PAGE

1. 얼음에 넣고 7.5 μL 5x Laemmli 샘플 버퍼 ⁶ 을 추가하여 반응을 중지하십시오.
2. 가열 블록에서 100 ° C에서 30 초에서 2 분간 가열하십시오.
3. 10-15 % SDS-PAGE 젤에서 스핀을 터치하고 웰 당 20 μL을로드하십시오. 겔을 키나아제와 기질을 분리 할 수있을만큼 충분히 길게하십시오 (일반적으로 5W의 일정한 출력에서 ​​1 시간). 겔 장치를 보호하여 ³² 노출을 제한하십시오 P.
   1. 여기에는 수제 젤 장치를 사용하지만 표준 상업적으로 판매되는 미니 젤은 완벽하게 적합합니다. 다음과 같이 치수를 사용하십시오.
      젤 : 폭 8 cm, 길이 5.5 cm (해상), 1.5 mm 두께.
      콤브 : 15 개의 우물, 1.5mm 두께, 2.9mm 폭, 16mm 깊이

4. 젤 염색 및 건조

주의 : 모든 단계에서 방사성 차폐를 사용하고 개인 보호 장비를 착용하여 개인 피폭을 ³² P로 줄이십시오. 특정 단계에 대한 자세한 내용은 유용한 참고 자료가 포함되어 있습니다.

1. 유리 / 알루미나 판에서 겔을 제거하고 50 rpm으로 설정 한 궤도 진탕 기에서 1 시간 동안 50 mL의 쿠마시 스테인 (10 % 빙초산, 50 % 메탄올, 0.25 % R-250 염료)에 넣습니다. 이 단계에서는 젤 자체보다 약간 큰 용기를 사용하십시오. ⁸
2. 젤을 얼룩에서 고정 용액 (10 % 빙초산d, 20 % 메탄올)를 사용하여 탈색시켰다. 50 rpm의 궤도 진탕 기에서 밤새 고형 용액 600-700 mL로 겔을 잠급니다. 쿠마시 염료 ^{8 , 9} 를 흡수하기 위해 젤이 들어있는 용기에 거품 조각 또는 매듭 된 실험용 물티슈를 놓습니다.
3. 정착액에서 겔을 제거하고 젤이 유백색으로 변할 때까지 약하게 흔들어 주면서 1-2 분 동안 메탄올 200 mL에 담급니다. 이렇게하면 건조 단계에서 균열을 방지하는 데 도움이됩니다.
4. 14 cm x 14 cm 크기의 정성 여과지를 메탄올로 적셔 슬라브 젤 진공 건조기 위에 놓습니다. 젤을 필터 종이 앞면이 위로 향하게 놓으십시오.
5. 주름과 기포를 방지하기 위해 조심스럽게 플라스틱 랩으로 젤을 덮으십시오. 건조기를 80 ° C에서 1.5 시간 동안 작동시킨다. 진공이 이루어지면 뚜껑을 열고 필요하면 부드러운 고무 판을 사용하여 공기 방울을 굴립니다.

5. Autoradiogram 및 섬광 계수

1. dri 제거인 겔을 부착하고 자동 끈 마커, 인광 성 눈금자 또는 도트를 겔의 측면에있는 여과지에 붙이십시오. 도트를 사용하는 경우 점들이 비대칭 패턴으로되어 있는지 확인하십시오. 이것은 노광 및 현상 후 겔을 필름과 정렬시킵니다.
2. Geiger 카운터를 사용하여 신호의 강도를 확인하십시오. 강화 된 화면에서 약 -70 ° C ~ -80 ° C의 약한 신호 노출의 경우 필름 밴드 밀도가 증가합니다.
3. 어두운 방에서 젤, 필름, 강화 스크린을 위에서 아래로 순서대로 필름과 강화 스크린이있는 필름 카세트에 말린 젤을 넣습니다.
4. 카세트의 뚜껑에 강화 스크린을 부착하고이 단계를보다 쉽게하기 위해 젤을 테이프로 붙이십시오. 강화 스크린은 32P에서 베타 입자에 의해 조사 될 때 빛을 방출합니다. 이러한 빛 방출은 베타 입자보다 더 효율적으로 필름을 관통합니다.
   1. 강화 화면에서 방출되는 파장이필름이 가장 민감한 파장의 연못.
   2. 가이거 계수기를 사용하여 노출 시간을 결정하십시오 : cpm 수가 ~ 100 이하이면 -70 ° C에서 하룻밤 시험하십시오. 카운트가 ~ 10,000이면 1 시간 노출로 시작하여 거기에서 최적화하십시오.
5. 노출이 끝나면 필름을 제거하고 의료 / X- 레이 필름 프로세서로 현상합니다. 노출을 -70 ~ -80 ° C에서 수행하는 경우 카세트를 실온으로 따뜻하게하여 응축이 발생하기 직전에 필름의 결로를 최소화하거나 필름을 제거하십시오.
6. 건조 된 젤 / 여과지 위에 필름을 놓고 마커 / 도트의 이미지를 마른 젤의 마커 / 점에 맞 춥니 다. 필름 표준에 해당하는 밴드를 표시하십시오. 단백질 기준에 라벨을 붙이고 나중에 참조 할 수 있도록 반응이 어떤 차선인지 표시하십시오.
7. 필름에서 관심있는 밴드에 해당하는 젤에서 밴드를 잘라내어 놓습니다.7 mL 신틸레이션 바이알에 넣었다. 신틸레이션 액 4 mL를 넣고 액체 섬광 계수기로 계산하십시오. 32P에 대한 올바른 에너지 스펙트럼 창을 모니터링하도록 카운터가 설정되어 있는지 확인하십시오.
   참고 : 노 키네아제 대조 레인에서 기질에 해당하는 밴드도 반드시 제거해야합니다. 이 값은 모든 샘플 신틸레이션 카운트에서 뺄 배경 방사선을 계산하는 데 사용됩니다.

6. 결과 분석

참고 : 오토 라디오 그램은 결과를 질적으로 시각화합니다. 정확한 정량을 위해 ³² P의 결합은 섬광 계수기로 측정 할 수 있습니다. 데이터는 일반적으로 그림 1B 와 같이 상대 활동으로 표시됩니다. 모든 샘플에 대해 균일 한 조건이 유지되는 한, 비 활동을 상대적으로 측정하면 치료를 비교할 수 있습니다.

1. 절대 특정 활동 값을 계산할 때는 엄격함을 수행하십시오.시간 경과에 따른 선형 활성 범위 ( 예 : 2 x [kinase] = 2 x specific activity)를 보장하기 위해 키나제, 기질 및 콜드 ATP 농도를 포함한 모든 반응 조건의 최적화. 높은 비 활동성 키나아제의 경우 키나아제 활성이 기질의 양에 의해 제한되는 경우 증가 된 기질 농도로 분석을 수행하십시오.
2. kinase 1mg / min 당 인산염 나노 몰 단위의 특정 키나아제 활성을 계산하시오.
   1. 계산 된 대역의 cpm에서 공백을 뺍니다.
   2. 뜨거운 ATP의 붕괴를 계산합니다 : [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0.95 여기서 t 는 기준 날짜 이후의 일 수입니다 (공급 업체가 제공해야 함), t _1/2 는 ³² P의 반감기는 14.3 일이며, 0.95는 섬광 계수기의 효율을 반영합니다. 예 : 28 일 된 고온 ATP를 사용하는 경우, 감소 값은 0.245 여야합니다.
   3. Calc(일반적으로 이것은 반응에서 감기 ATP의 양과 동일하다) : 분석 용적 (μL) × [냉 ATP] (μM) = 전체 ATP (pmols). 예 : 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
   4. cpm / pmol ATP를 계산하시오 : [cold ATP x (2.2 x 107) x decay factor] / cold ATP의 pmol.
      참고 : 2.2 x 10 ⁷ 값은 0.01 mCi / μL의 ATP를 cpm으로 변환합니다.
   5. 분석에서 키나아제의 양을 mg 단위로 계산하십시오. 재조합 키나아제 및 면역 침전 된 키나아제 모두, BCA 분석법과 같은 표준 방법이 출발 농도를 결정하는 데 적합하다. 예 : 50μL 키나아제 반응에서 wtERK2 0.0002 μg / μL은 0.01 μg 또는 1 x ^10-5 mg입니다.
   6. 분석에서 총 cpm을 계산하십시오. 30 μL 반응을 조립하고 젤의 각 반응에서 20 μL를 실행하십시오. 계산 된 cpm (공백 빼기 후)에 총 분석 용적 / 적재량 계수를 곱하십시오. 위의 계속하기예를 들어 모든 계수에 1.5를 곱하거나 30/20을 곱합니다.
   7. 분석 된 키나아제의 특정 활성을 계산하십시오 :
      분석에서 총 cpm) / (cpm / pmol ATP) / (분석 시간 (분)) / (키나아제의 양)
      참고 : 위의 값을 1,000으로 나눈 값은 나노 몰 / 분 / mg
3. 기질에 얼마나 많은 인산이 포함되어 있는지 계산합니다 (분자량이 알려진 한). 이것은 일단 반응이 완료되면 특정 단백질의 포스 포 사이트 수를 결정하는 데 사용됩니다.
   분석에서 총 cpm) / (cpm / pmol ATP)] / (pmole에서 기질의 양)

결과

WNK1 IP 키나제 검정

Myc- 표지 된 WNK1을 HEK293 세포로 형질 감염시키고 항 -IcC 항체 ^11로 면역 침전시켰다. 면역 침전물은 모델 기질 MBP뿐만 아니라 그 자체로 키나아제 활성을 나타내었다 ( 도 1A ). WNK1 돌연변이 체는 MBP에 대한 키나아제 활성을 동일한 방법으로 시험하였고, 이번에는 GST- 태깅 된 구조?...

토론

키나아제는 다양한 환경에서 광범위한 기능을 발휘하는 다양한 단백질 군으로 키나아제 분석법은 여러 가지 신호 전달 단백질을 연구하는데 매우 유용하며 세포 통신에 대한 현재의 이해에 크게 기여했습니다. 특히, 구조 및 활성의 주요한 차이에도 불구하고 2 개의 상이한 키나아제를 특성화하는데 동일한 기본 분석이 사용되었다. WNK1 키나아제는 중요한 리신이 독특한 위치로 이동 한 비정형 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500