Dosage de l'activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Résumé

Les protéines kinases sont des enzymes de signalisation hautement évoluées et des échafaudages qui sont essentiels pour la transduction du signal inter et intracellulaire. Nous présentons un protocole pour mesurer l'activité de la kinase par l'utilisation d'adénosine triphosphate radiomarqué ([γ- ³² P] ATP), une méthode fiable pour faciliter l'élucidation de la régulation de la signalisation cellulaire.

Résumé

Les protéines kinases sont capables de gouverner les changements cellulaires à grande échelle en réponse à des séries complexes de stimuli, et beaucoup d'efforts ont été dédiés à la découverte des détails allostériques de leur réglementation. Les kinases comprennent des réseaux de signalisation dont les défauts sont souvent caractéristiques de multiples formes de cancer et de maladies apparentées, ce qui rend possible une manipulation des facteurs de régulation en amont et la validation des exigences de réaction critiques pour la recherche de thérapies améliorées. Ici, nous décrivons un dosage basique de la kinase qui peut être facilement adapté aux questions expérimentales spécifiques, y compris, mais sans s'y limiter, le test des effets des agents biochimiques et pharmacologiques, des manipulations génétiques telles que la mutation et la suppression, ainsi que les conditions de culture cellulaire et les traitements pour sonder Mécanismes de signalisation cellulaire. Ce dosage utilise l'ATP [γ- ³² P] radiomarqué, qui permet des comparaisons quantitatives et une visualisation claire des résultats, et peut être modPour utilisation avec de la kinase immunoprécipitée ou recombinante, des substrats spécifiques ou typés, dans toute une large gamme de conditions de réaction.

Introduction

Les protéines kinases sont des enzymes sophistiquées critiques pour la transmission de signaux cellulaires en réponses appropriées ¹ . Étant donné leur rôle dans le maintien de l'homéostasie et la prévention ou la promotion des états pathologiques ² , les méthodes biochimiques pour évaluer l'activité kinase continuent d'être des outils puissants pour délimiter les particularités de la signalisation eucaryote ³ . Bien que les stratégies utilisant des anticorps spécifiques de phospho aient été très informatives en termes de mesure des effets de différentes conditions de traitement sur l'état de signalisation cellulaire ⁴ , un dosage de kinase permet de mesurer directement les effets de différentes conditions de traitement en termes d'activité enzymatique d'une kinase de intérêt. Bien qu'il existe plusieurs options pour des analyses similaires qui n'utilisent pas de matières radioactives ⁵ , nous continuons de compter sur cette méthode pour une quantification robuste des résultats. LàSont deux applications typiques de ce dosage, à la fois précieuses pour différentes raisons: l'essai immunoprécipité (IP) kinase ( figure 1 ) et le dosage recombinant de la protéine kinase ( figure 2 ).

Le test de la kinase IP est extrêmement utile pour identifier les facteurs capables d'activer des protéines kinases spécifiques ainsi que d'évaluer les conditions de traitement inhibiteur. En bref, une kinase marquée par un epitope d'intérêt est transfectée dans des cellules eucaryotes cultivées, soumise à une variété de traitements, immunoprécipitée et testée pour pouvoir incorporer un phosphate radiomarqué dans un substrat modèle ( par exemple, une protéine basique de myéline (MBP)). Le test de la kinase IP peut également être effectué sans recourir à une surexpression, soit par immunoprécipitation de protéines endogènes, soit par n'importe quel nombre de techniques de modification du génome. Parce que les traitements sont administrés en culture, cette méthode peut détecter les stimulations transmises par plusieurs facteurs en amontOu des chemins parallèles par lecture in vitro . L'un des principaux avantages de cette méthode est qu'il ne nécessite pas une connaissance préalable des facteurs directs en amont ou en aval ou des sites de phosphorylation. En outre, une fois que des substrats spécifiques pour une kinase d'intérêt ont été identifiés, le même protocole de dosage de kinase peut être utilisé avec des composants recombinants pour mesurer une activité spécifique vis-à-vis des substrats naturels et identifier des sites de phosphorylation spécifiques lorsqu'ils sont combinés avec une analyse par spectrométrie de masse. Les sites identifiés de cette manière peuvent encore être validés avec des dosages de kinase en utilisant des mutants de substrat. Enfin, cette méthode peut également être utilisée pour détecter et mesurer l'autophosphorylation.

Le protocole fourni ici suppose soit un schéma de purification de protéine optimisé, soit un procédé de transfection pour exprimer une kinase marquée par une affinité intéressant dans des cellules cultivées. Pour des expositions plus détaillées de la transfection, de la lyse, de l'immunoprécipitation et de la purification des protéines protOcols, nous suggérons de se référer aux protocoles Cold Spring Harbor ⁶ . Pour plus d'informations sur le développement et la modification des analyses, veuillez consulter la Phosphorylation des protéines: Méthodes choisies en Enzymologie ⁷ .

Protocole

1. Ressources de purification de la kinase et pipeline général d'immunoprécipitation

NOTE: Les kinases à utiliser avec ce dosage peuvent provenir d'immunoprécipités de cellules cultivées ou par des moyens recombinants tels que l'épuration par affinité ⁶ . Ci-dessous est un protocole général pour l'immunoprécipitation marquée par un drapeau qui peut devoir être modifié en fonction de la kinase d'intérêt. Tout devrait être conservé sur la glace si possible.

1. Ajouter 2 μL d'anticorps de 1 mg / mL à 200 μL de lysats cellulaires (habituellement ~ 1 mg / mL de concentration totale de protéines) et incuber à 4 ° C pendant 1 h tout en basculant.
2. Se laver les grains de protéine A sepharose 2-3 fois avec un tampon de lyse (voir ci-dessous) en faisant tourner brièvement à 4 ° C pendant 30 s à 1 min à 5 000 xg ("essorage tactile"), en enlevant le surnageant avec une pipette et en remettant des billes en tampon .
   1. Préparer un tampon de lyse: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl ₂ 1,5 mM, EGTA 1 mM, 10% de glycerol, 0,3 mM d'orthovanadate de sodium, 100 mM de fluorure de sodium, 50 mM de β-glycérophosphate, 0,1% de Triton X 100 ou 0,1% de NP-40.
3. Ajouter 30 μL de bouillie à 50% de billes de sepharose protéine A dans un tampon de lyse à des lysats; Incuber à 4 ° C pendant 1 h tout en basculant.
4. Faire tourner à 4 ° C pour rallumer les perles et enlever le surnageant.
5. Laver 3 fois avec 1 ml de tampon de lavage de talons (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4).
6. Laver une fois avec un tampon de réaction 1x kinase (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Retirez autant de tampon que possible sans enlever les perles.

2. Initialisation des réactions de la kinase

NOTE: Pour les tests de kinase IP, ~ 15 μL de perles non suspendues est un échantillon de départ typique. Pour les tests de protéine kinase recombinants, les quantités de départ typiques vont de 0,1 à 1,0 μg en 1 à 10 pour 25-50 μL de volumes de réaction finale. Ajuster les volumes d'échantillon de protéines recombinantesS pour être égal avec le tampon qu'ils sont stockés avant d'initialiser l'analyse. Lors de l'utilisation de quantités élevées de kinase, inclure une protéine porteuse telle que la BSA pour faciliter le maintien de la stabilité des protéines pendant la durée de l'essai.

1. Préparer le tampon de réaction 5x kinase donné ci-dessous:
   HEPES 50 mM pH 8,0
   50 mM de MgCl ₂
   50 mM de Benzamidine (inhibiteur de protéase)
   50 mM de DTT (agent de réduction)
   ATP 250 μM (non étiqueté ou "froid")
2. Conserver les échantillons de kinase sur de la glace dans des tubes de 1,5 mL. Préparer le mélange réactionnel suivant dans des tubes séparés et réfrigérés de 1,5 mL:
   21 μL H ₂ O
   6 μL de tampon de réaction kinase 5x
   1 μL d'ATP radiomarqué ("chaud")
   2 μL de substrat (~ 5 mg / mL)
   NOTE: Pour les dosages de kinase recombinante, le volume peut être ajusté pour s'adapter à la protéine purifiée. Calculez que le volume de réaction final soit de 30 μL. Utilisez cette recette pour préparer un maîtremélanger. Après réception de l'ATP marqué, diluer le stock dans H ₂ O à une activité spécifique de 0,01 mCi / μL avant d'ajouter au mélange réactionnel.
3. Pour initialiser le dosage, ajouter tout le mélange réactionnel à l'échantillon de kinase et incuber la réaction à 30 ° C pendant 5 min à 1 h en fonction de l'activité de la kinase à analyser.
   REMARQUE: lorsque vous travaillez avec une kinase dont l'activité n'a pas été préalablement analysée, effectuez un temps d'activité kinase avec des intervalles de 5 minutes entre les points de temps.

3. Résiliation de réaction et SDS-PAGE

1. Arrêter la réaction en mettant de la glace et en ajoutant 7,5 μL de tampon 5 d'échantillon de Laemmli ⁶ .
2. Chauffer à 100 ° C pendant 30 s à 2 min dans un bloc de chaleur.
3. Faire tourner et charger 20 μL par puits sur un gel SDS-PAGE à 10-15%. Exécutez le gel assez longtemps pour séparer la kinase et le substrat (typiquement 1 h à une puissance constante de 5 W) Assurez-vous de garder l'appareil gel protégé pour limiter l'exposition à ³² P.
   1. Ici, utilisez des appareils de gel maison, mais les mini-gels standard disponibles dans le commerce sont parfaitement adaptés. Utilisez les dimensions comme suit:
      Gels: 8 cm de largeur, 5,5 cm de longueur (résolution), 1,5 mm d'épaisseur.
      Combs: 15 puits, épaisseur 1,5 mm, largeur 2,9 mm, profondeur 16 mm

4. Coloration et séchage du gel

Attention: pour toutes les étapes, assurez-vous de réduire l'exposition personnelle à ³² P en utilisant un blindage radioactif et portant un équipement de protection individuelle. Pour plus d'informations sur les étapes spécifiques, des références utiles sont incluses.

1. Retirez le gel des plaques de verre et d'alumine et placez dans 50 mL de colorant Coomassie (10% d'acide acétique glacial, 50% de méthanol, 0,25% de colorant R-250) pendant 1 h sur un agitateur orbitaire réglé à 50 tours par minute. Pour cette étape, utilisez un conteneur légèrement plus grand que le gel lui-même. ⁸
2. Déplacez le gel de la solution à la solution de fixation (10% d'acide acétique glacialD, 20% de méthanol) afin de décocher. Faire passer le gel dans 600 à 700 ml de solution de fixation pendant une nuit sur un agitateur orbital à 50 tr / min. Placez des morceaux de mousse ou des lingettes de laboratoire nouées dans le récipient avec le gel pour absorber le colorant Coomassie ^{8 , 9} .
3. Retirer le gel de la solution de fixation et tremper dans 200 ml de methanol pendant 1-2 minutes avec une agitation douce jusqu'à ce que le gel devienne blanc laiteux. Cela aidera à prévenir les fissures pendant l'étape de séchage.
4. Mouillez un papier filtrant qualitatif de 14 cm x 14 cm avec du methanol et placez-le sur un séchoir à vide en gel de dalle. Posez le gel sur le papier filtre face avant vers le haut.
5. Couvrez soigneusement le gel avec une enveloppe en plastique pour éviter les rides et les bulles d'air. Faites fonctionner la sécheuse pendant 1,5 h à 80 ° C. Une fois que le vide a été atteint, ouvrir le couvercle et déployer toutes les bulles d'air si nécessaire avec un frein en caoutchouc doux.

5. Autoradiogramme et chiffres de scintillation

1. Retirer driEt fixez un marqueur autorad, une règle phosphorescente ou des points au papier filtre sur le côté du gel. Si vous utilisez des points, assurez-vous qu'ils sont dans un motif asymétrique. Cela alignera le gel avec le film après l'exposition et le développement.
2. Utilisez un compteur Geiger pour vérifier l'intensité du signal. Pour une exposition plus faible aux signaux à -70 ° C à -80 ° C avec un écran intensifiant, la densité de la bande de film augmentera.
3. Dans une pièce noire, placez un gel séché dans une cassette de film avec un film et un écran intensifiant dans l'ordre suivant de haut en bas: gel, film, écran intensifiant.
4. Fixez l'écran intensifiant sur le couvercle de la cassette et tapez le gel en place pour faciliter cette étape. L'écran intensif émet de la lumière lorsqu'il est irradié par les particules bêta des ³² P. Ces émissions lumineuses pénètrent le film plus efficacement que les particules bêta.
   1. Assurez-vous que la longueur d'onde émis par l'écran intensif correspondDes étangs à une longueur d'onde dont le film est le plus sensible.
   2. Utilisez un compteur Geiger pour déterminer combien de temps laisser l'exposition pour: si le nombre de cpm est de ~ 100 ou moins, essayez la nuit à -70 ° C. Si le nombre est de ~ 10 000, commencez par une exposition de 1 heure et optimisez-vous à partir de là.
5. À la fin de l'exposition, retirez le film et développez-le dans un processeur médical / film de rayons X. Si l'exposition a été effectuée à -70 à -80 ° C, soit permettre à la cassette de se réchauffer à température ambiante pour minimiser la condensation sur le film ou enlever le film immédiatement avant la formation de condensation ¹⁰ .
6. Posez le film sur le gel / papier filtre séché et alignez l'image du marqueur / points avec les marqueurs / points sur le gel séché. Marquez sur le film les bandes correspondant aux normes de protéines. Étiquetez les normes de protéines et quelles voies les réactions sont destinées à une référence ultérieure.
7. Accise les bandes du gel qui correspondent aux bandes d'intérêt sur le film et placez-lesDans des flacons de scintillation de 7 mL. Ajouter 4 mL de fluide scintillant et compter avec un compteur à scintillation liquide. Confirmez que le compteur est configuré pour surveiller la fenêtre de spectre d'énergie correcte pour ³² P.
   REMARQUE: Assurez-vous également d'acciser la bande correspondant au substrat de la voie de contrôle sans kinase. Ceci sera utilisé pour calculer le rayonnement de fond qui sera soustrait de tous les comptes de scintillation d'échantillons.

6. Analyse des résultats

NOTE: L'autoradiogramme fournit une visualisation qualitative des résultats. Pour une quantification précise, l'incorporation de ³² P peut être mesurée avec un compteur à scintillation. Les données sont généralement exprimées en termes d'activité relative, comme le montre la figure 1B . Tant que des conditions uniformes sont maintenues pour tous les échantillons, les mesures relatives de l'activité spécifique sont suffisantes pour comparer les traitements.

1. Lors du calcul des valeurs d'activité spécifique absolue, effectuer une rigueurOptimisation de toutes les conditions de réaction, y compris les concentrations de kinase, de substrat et d'ATP froide, afin d'assurer une gamme d'activité linéaire sur une durée ( p. Ex. 2 x [kinase] = 2 x activité spécifique). Pour les kinases ayant une activité spécifique élevée, effectuer des analyses avec une concentration accrue du substrat dans le cas où l'activité kinase est limitée par la quantité de substrat.
2. Calculer l'activité spécifique de kinase d'intérêt dans des unités de nanomoles phosphate transférées par minute par mg de kinase.
   1. Soustraire les blancs du cpm dans les bandes comptées.
   2. Calculer la désintégration de l'ATP chaud: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0,95 où t est le nombre de jours depuis la date de référence (devrait être fourni par le fournisseur), t _1/2 est le Demi-vie de ³² P, soit 14,3 jours, et 0,95 reflète l'efficacité du compteur de scintillation. Exemple: si vous utilisez un ATP chaud de 28 jours, la valeur de désintégration devrait être de 0,245.
   3. CalcUlate les picomoles (pmol) de l'ATP total dans le dosage (habituellement ceci est égal à la quantité d'ATP froid dans la réaction): volume d'analyse (μL) x [ATP froid] (μM) = ATP total (pmoles). Exemple: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
   4. Calculer cpm / pmol ATP: [μL d'ATP x chaud (2,2 x 10 ⁷ ) x facteur de désintégration] / pmol d'ATP froid.
      NOTE: La valeur de 2,2 x 10 ⁷ convertit 0,01 mCi / μL d'ATP en cpm.
   5. Calculer la quantité de kinase dans le dosage en mg. Pour la kinase recombinante et les kinases immunoprécipitées, des procédés classiques tels que les dosages BCA conviennent pour déterminer les concentrations de départ. Exemple: wtERK2 0,0002 μg / μL dans une réaction de 50 μL de kinase est de 0,01 μg, ou 1 x 10 ^-5 mg.
   6. Calculez les cpm totales dans le dosage. Assembler 30 μL de réactions et exécuter 20 μL de chaque réaction sur un gel. Multipliez le cpm compté (après soustraction vierge) par un facteur de volume / volume d'analyse total chargé. Poursuivre ce qui précèdeExemple, multipliez tous les chiffres par 1,5 ou 30/20.
   7. Calculer l'activité spécifique de la kinase analysée:
      Cpm total dans le dosage) / (cpm / pmol ATP) / (temps de dosage en minutes) / (quantité de kinase en mg)
      REMARQUE: diviser la valeur ci-dessus en 1000 donne l'activité spécifique en nanomoles / minute / mg
3. Calculer combien de moles de phosphate sont incorporées dans un substrat (tant que sa masse moléculaire est connue). Ceci est utilisé pour déterminer le nombre de phosphosites sur une protéine particulière une fois la réaction terminée.
   Cpm total dans le dosage) / (cpm / pmol ATP)] / (quantité de substrat en pmol)

Résultats

WNK1 tests de kinase IP

Le WNK1 marqué par Myc a été transfecté dans des cellules HEK293 et ​​immunoprécipité avec un anticorps anti-Myc ¹¹ . L'immunoprécipité montre une activité kinase vers le substrat modèle MBP ainsi que vers lui-même ( figure 1A ). Les mutants WNKl ont ensuite été testés pour l'activité kinase vers le MBP par la même méthode, employant cet...

Discussion

Les kinases sont une famille variée de protéines qui ont développé une fonctionnalité étendue dans de nombreux contextes, et les analyses de kinase ont été incroyablement utiles dans l'étude de plusieurs protéines de signalisation et ont largement contribué à notre compréhension actuelle de la communication cellulaire. Notamment, le même dosage de base a été utilisé pour caractériser deux kinases disparates en dépit de grandes différences de structure et d'activité. La kinase WNK1 contient u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500