Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Summary

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- ³² P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Abstract

קינאזות חלבונים מסוגלים לשלוט בשינויים תאיים בקנה מידה גדול בתגובה למערכים מורכבים של גירויים, ומאמץ רב הופנה לחשוף פרטים אלסטריים של הרגולציה שלהם. קינאזות הן רשתות איתות אשר פגמים הם לעתים קרובות סימני ההיכר של צורות רבות של סרטן ומחלות נלוות, מה שהופך פלטפורמת assay מקובל מניפולציה של גורמים רגולטוריים במעלה הזרם ואת האימות של דרישות התגובה קריטי בחיפוש אחר טיפול משופר. כאן, אנו מתארים assay קינאז בסיסי שניתן להתאים בקלות כדי להתאים שאלות ניסיוניות ספציפיות, כולל אך לא מוגבל לבדיקת ההשפעות של סוכני ביוכימי ופרמקולוגי, מניפולציות גנטיות כגון מוטציה ומחיקה, כמו גם התנאים תרבות התא וטיפולים בדיקה מנגנוני איתות תא. Assay זה מנצל radiolabeled [γ- ³² P] ATP, המאפשר השוואות כמותיות הדמיה ברורה של התוצאות, והוא יכול להיות modאם נעשה שימוש עם קינאז immunoprecipitated או רקומביננטי, מצעים ספציפיים או מאופיינים, בכל רחבי מגוון רחב של תנאי תגובה.

Introduction

קינאזות חלבון הן אנזימים מתוחכמים קריטיים להעברת אותות סלולריים לתגובות הולמות ¹ . בהתחשב בתפקידים שלהם בשמירה על הומאוסטזיס ומניעה או קידום של מצבי מחלה ² , שיטות ביוכימיות להערכת פעילות קינאז ממשיכות להיות כלים רבי עוצמה לתיאור הפרטים של איתות אוקריוטי ³ . למרות אסטרטגיות ניצול נוגדנים ספציפיים phospho כבר אינפורמטיבי מאוד במונחים של מדידת ההשפעות של תנאי טיפול שונים על מצב איתות תא ⁴ , assay קינאז מאפשר למדוד את ההשפעות של תנאי טיפול שונים ישירות במונחים של פעילות אנזימטית של קינאז של ריבית. אמנם יש מספר אפשרויות עבור מבחני דומים שאינם משתמשים בחומרים רדיואקטיביים ⁵ , אנו ממשיכים להסתמך על שיטה זו quantitation חזק של תוצאות. שםהם שני יישומים טיפוסיים של assay זה, שניהם בעלי ערך מסיבות שונות: assay immunoprecipitated (IP) קינאז ( איור 1 ) ואת assay חלבון רקומביננטי קינאז ( איור 2 ).

Assay IP Kinase הוא שימושי מאוד עבור זיהוי גורמים המסוגלים להפעיל קינאזות חלבון ספציפיים, כמו גם לאמוד תנאי טיפול מעכב. בקצרה, קינאז אפיטופ מתויג של עניין הוא transfected לתאי eukaryotic תרבותי, נתון למגוון של טיפולים, immunoprecipitated, assayed על היכולת לשלב פוספט radiolabeled לתוך מצע מודל ( למשל myelin בסיסי חלבון (MBP)). Assay IP kinase יכול להתבצע גם מבלי להזדקק overexpression, או על ידי immunoprecipitation של חלבון אנדוגני או כל מספר של טכניקות עריכת הגנום. בגלל טיפולים מנוהלים בתרבות, שיטה זו יכולה לזהות גירויים המועברים באמצעות גורמים במעלה מרוביםאו מסלולים מקבילים על ידי readout במבחנה . אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא כי היא אינה דורשת ידע מוקדם של גורמים במעלה או במורד הזרם ישיר או אתרי זרחן בו. יתר על כן, לאחר מצעים ספציפיים עבור קינאז של עניין זוהו, אותו פרוטוקול assay קינאז ניתן להשתמש עם רכיבים רקומביננטי למדוד פעילות ספציפית כלפי מצעים טבעיים לזהות אתרי זרחן ספציפיים בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה. אתרים המזוהים בצורה זו ניתן לאמת עוד עם מבחני קינאז ניצול מוטציות המצע. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות ולמדוד autophosphorylation.

פרוטוקול בתנאי כאן מניח או מטוהרים חלבון אופטימיזציה או שיטת transfection להביע קינאז מתויג זיקה של עניין בתרבית תאים. לקבלת תערוכות מפורטות יותר של transfection, תמוגה, immunoprecipitation, ואת חלבון טיהור מגןOcols, אנו מציעים להתייחס פרוטוקול הקרה האביב הארבור ⁶ . לקבלת מידע נוסף לגבי פיתוח assay ושינוי, עיין פרוטאין זרחון: שיטות נבחרות אנזימולוגיה ⁷ .

Protocol

1. קינאז טיהור משאבים כללי Immunoprecipitation צינור

הערה: קינאזות לשימוש עם assay זה עשוי להיות שמקורו immunoprecipitates של תאים בתרבית או על ידי אמצעים רקומביננטי כגון זיקה מתוייגים טיהור ⁶ . להלן פרוטוקול כללי דגל תיוג immunoprecipitation כי ייתכן שיהיה שונה בהתאם kinase של עניין. הכל צריך להישמר על הקרח במידת האפשר.

1. הוסף 2 μL של נוגדן 1 מ"ג / מ"ל ​​ל 200 μL של lysates התא (בדרך כלל ~ 1 מ"ג / מ"ל ​​ריכוז החלבון הכולל) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה בעת נדנדה.
2. לשטוף חלבון חרוזי sepharose 2-3 פעמים עם חיץ תמוגה (ראה להלן) על ידי ספינינג בקצרה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 1 x ב 5000 xg ("מגע ספין"), הסרת supernatant עם פיפטה, חרוזים resuspending במאגר .
   1. הכן חיץ תמוגה: 50 מ"מ HEPES pH 7.7, 150 מ"מ NaCl, 1.5 מ"מ MgCl ₂, 1 מ"מ EGTA, 10% גליצרול, 0.2 mM נתרן orthovanadate, 100 מ"מ נתרן פלואוריד, 50 מ"מ β-glycerophosphate, 0.1% Triton X 100 או 0.1% NP-40.
3. הוסף 30 μL של 50% slurry של חלבון חרוזי sepharose במאגר תמוגה כדי lysates; דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בזמן נדנדה.
4. מגע ספין ב 4 ° C כדי גלולה חרוזים ולהסיר את supernatant.
5. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף חרוז (1 M NaCl, 20 מ"מ טריס pH 7.4).
6. לשטוף פעם עם 1x kinase התגובה חיץ (10 מ"מ HEPES pH 8.0, 10 מ"מ MgCl ₂ ). הסר חיץ ככל האפשר מבלי להסיר חרוזים.

2. אתחול תגובות קינאז

הערה: עבור מבחני קינאז IP, ~ 15 μL של חרוזים מושעה הוא מדגם מתחיל טיפוסי. עבור מבחני קינאז חלבון רקומביננטי, כמויות החל טיפוסי החל מ 0.1-1.0 מיקרוגרם ב 1-10 עבור 25-50 μL נפח התגובה הסופית. התאם את הכרכים של מדגם חלבון רקומביננטיS להיות שווה עם המאגר הם מאוחסנים לפני אתחול assay. בעת שימוש בכמויות גבוהות של קינאז, לכלול חלבון המוביל כגון BSA כדי לסייע בשמירה על יציבות החלבון למשך assay.

1. הכן את חיץ התגובה 5x kinase להלן:
   50 מ"מ HEPES pH 8.0
   50 מ"מ MgCl ₂
   50 מ"מ Benzamidine (מעכב פרוטאז)
   50 מ"מ DTT (סוכן הפחתת)
   250 מיקרומטר ATP (ללא תווית, או "קר")
2. שמור דגימות קינאז על הקרח צינורות 1.5 מ"ל. הכינו את תערובת התגובה הבאה, צינורות צוננים 1.5 מ"ל נפרד:
   21 μL H ₂ O
   6 μL 5x חיץ התגובה kinase
   1 μolabel μL ("חם") ATP
   2 מצע μL (~ 5 מ"ג / מ"ל)
   הערה: עבור מבחני קינאז רקומביננטי, נפח עשוי להיות מותאם כדי להתאים חלבונים מטוהרים. חישוב כזה נפח התגובה הסופית היא 30 μL. השתמש מתכון זה להכין הוריםלְעַרְבֵּב. עם קבלת ATP שכותרתו, לדלל מלאי H ₂ O לפעילות ספציפית של 0.01 mCi / μL לפני הוספת תערובת התגובה.
3. כדי לאתחל את assay, להוסיף תערובת התגובה כולה מדגם kinase ו דגירה תגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות עד 1 שעות בהתאם לפעילות של kinase להיות assayed.
   הערה: כאשר אתה עובד עם קינאז שפעילותו לא נבדקה בעבר, בצע את מהלך הזמן של פעילות קינאז עם מרווחי 5 דקות בין נקודות זמן.

3. סיומת תגובה SDS-PAGE

1. להפסיק את התגובה על ידי לשים על קרח הוספת 7.5 μL 5x Laemmli חיץ מדגם ⁶ .
2. מחממים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 2 דקות בבלוק חום.
3. מגע ספין לטעון 20 μL לכל טוב על 10-15% SDS-PAGE ג'ל. הפעל ג'ל מספיק זמן כדי להפריד בין קינאז המצע (בדרך כלל 1 שעות על כוח קבוע של 5 W) הקפד לשמור על מנגנון ג 'ל מוגן להגביל את החשיפה ³² P.
   1. הנה, להשתמש במכשירים ג'ל תוצרת בית, אבל סטנדרטי מינימלי זמין מסחרית ג'ל מתאימים לחלוטין. השתמש בממדים באופן הבא:
      ג'לים: רוחב 8 ס"מ, אורך 5.5 ס"מ (פתרון), עובי 1.5 מ"מ.
      מסרקים: 15 בארות, עובי 1.5 מ"מ, רוחב 2.9 מ"מ, עומק 16 מ"מ

4. מכתים ג'ל וייבוש

זהירות: עבור כל השלבים הקפד להפחית את החשיפה האישית ל ^-32 P באמצעות שימוש במיגון רדיואקטיבי ובביגוד בציוד מגן אישי. לקבלת מידע נוסף על שלבים ספציפיים, כלול הפניות מועילות.

1. הסר את הג'ל מזכוכית / צלחות אלומינה מקום ב 50 מ"ל כתם קומסי (10% חומצה אצטית קרח, 50% מתנול, 0.25% R-250 צבע) במשך שעה 1 על שייקר מסלולית להגדיר 50 סל"ד. עבור שלב זה להשתמש במיכל כי הוא מעט גדול יותר מאשר ג 'ל עצמו. ⁸
2. להזיז את הג'ל מ כתם לפתרון פתרון (10% aci aci קרחוניד, 20% מתנול) כדי דה-כתם. סלע את הג'ל ב 600-700 מ"ל של פתרון תיקון לילה על שייקר מסלולית ב 50 סל"ד. מקום חתיכות של קצף או מגבונים מעבדה מרוכזת במיכל עם ג'ל לספוג את צבע קומסי ^{8 , 9} .
3. הסר ג'ל מ תיקון פתרון ולספוג 200 methanol מ"ל עבור 1-2 דקות עם תסיסה עדינה עד ג 'ל הופך לבן חלבי. זה יסייע למנוע פיצוח במהלך שלב ייבוש.
4. רטוב 14 ס"מ x 14 חתיכת ס"מ של נייר סינון איכותי עם מתנול ומקום על משטח ואקום מייבש ואקום. הנח את הג'ל על הצד הקדמי של נייר המסנן ופנה כלפי מעלה.
5. מכסים את הג'ל בעטיפת פלסטיק בזהירות, כדי למנוע קמטים בועות אוויר. הפעל את המייבש עבור 1.5 שעות ב 80 ° C. לאחר הוואקום הושג לפתוח את המכסה לגלגל את כל בועות אוויר במידת הצורך עם ברכה גומי רך.

5. אוטורדיוגרמה וספירת סינטילציה

1. הסר את הגשםג'ל אד ולצרף סמן autorad, סרגר זרחני או נקודות על נייר הסינון בצד של הג'ל. אם באמצעות נקודות לוודא שהם נמצאים דפוס אסימטרי. זה יהיה ליישר את הג'ל עם הסרט לאחר החשיפה והפיתוח.
2. השתמש מונה גייגר לבדוק את עוצמת האות. עבור חלשות אותות חלש ב -70 מעלות צלזיוס ל -80 מעלות צלזיוס עם מסך הגברת תגדיל את צפיפות הלהקה הסרט.
3. בחדר חשוך לשים ג'ל יבש בתוך קלטת הסרט עם הסרט ואת המסך הגובר בסדר הבא מלמעלה למטה: ג'ל, הסרט, מסך מגביר.
4. צרף את המסך הגובר למכסה של הקלטת ואת הקלטת ג'ל במקום לעשות צעד זה יותר קל. המסך החזק פולט אור כאשר מוקרן על ידי חלקיקי בטא מ ³² P. אלה פליטות האור לחדור את הסרט בצורה יעילה יותר מאשר חלקיקי בטא.
   1. ודא את אורך הגל הנפלט corres המסך הגוברתבריכות לאורך גל הסרט הכי רגיש.
   2. השתמש מונה גייגר כדי לקבוע כמה זמן לעזוב את החשיפה עבור: אם ספירת cpm הוא ~ 100 או למטה, לנסות לילה ב -70 ° C. אם הספירה היא ~ 10,000, להתחיל עם חשיפה 1 שעות ו לייעל משם.
5. בסיום החשיפה להסיר את הסרט ולפתח במעבד הסרט הרפואי / רנטגן. אם החשיפה בוצעה ב -70 ל -80 מעלות צלזיוס, או לאפשר את הקלטת לחמם לטמפרטורת החדר כדי למזער עיבוי על הסרט או להסיר את הסרט מיד לפני צורות עיבוי ¹⁰ .
6. הנח את הסרט על נייר ג'ל יבש / מסנן וליישר את התמונה של הסמן / נקודות עם סמנים / נקודות על ג'ל יבש. סמן על הסרט להקות המתאימות לסטנדרטים של חלבון. תווית את הסטנדרטים חלבון אשר נתיבים התגובות הן לעיון בעתיד.
7. הבלו את להקות מן הג'ל התואמות להקות של עניין על הסרט ומניחים אותםב 7 מ"ל בקבוקונים scintillation. הוסף 4 מ"ל של נוזל נצנוץ לספור עם נוזל נצנץ נוזל. אישור הדלפק מוגדר לפקח על חלון ספקטרום האנרגיה הנכון עבור ³² P.
   הערה: הקפד גם לבלו את הלהקה התואמת את המצע משלב הבקרה no-kinase. זה ישמש לחישוב קרינת הרקע כי יהיה מנוכה מכל ספירת scintillation.

6. ניתוח התוצאות

הערה: autoradiogram מספק הדמיה איכותית של התוצאות. עבור quantitation מדויק, ³² P שילוב ניתן למדוד עם הדלפק נצנץ. הנתונים מתבטאים בדרך כלל במונחים של פעילות יחסית, כפי שמוצג באיור 1 ב . כל עוד נשמרים תנאים אחידים לכל הדגימות, מדידות יחסית של פעילות ספציפית מספקות כדי להשוות בין טיפולים.

1. בעת חישוב ערכי פעילות ספציפיים מוחלטים, בצע קריטריוןOus אופטימיזציה של כל תנאי התגובה, כולל קינאז, המצע, ריכוזי ה- ATP קר, על מנת להבטיח טווח ליניארי של פעילות על פני זמן הקורס ( למשל 2 x [קינאז] = 2 x פעילות ספציפית). עבור קינאזות עם פעילות ספציפית גבוהה, לבצע מבחני עם ריכוז המצע מוגברת במקרה פעילות קינאז מוגבל על ידי כמות המצע.
2. חישוב הפעילות הספציפית של kinase עניין ביחידות של פוספט ננומלס מועבר לכל min לכל קינאז מ"ג.
   1. החסר החסר מן הדקה ב להקות ספור.
   2. לחשב את ריקבון ה- ATP החם: [1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0.95 כאשר t הוא מספר הימים מאז תאריך ההתייחסות (אמור להינתן על ידי הספק), t _1/2 הוא מחצית חיים של ³² P, שהוא 14.3 ימים, ו 0.95 משקף את היעילות של הדלפק נצנץ. דוגמה: אם אתה משתמש ATP חם כי הוא בן 28 ימים, הערך ריקבון צריך להיות 0.245.
   3. Calc(Polololes (pmol) של ATP הכולל assay (בדרך כלל זה שווה את כמות ATP קר התגובה): נפח assay (μL) x [קר ATP] (מיקרומטר) = סך ATP (pmols). דוגמה: 30 μL x 50 מיקרומטר = 1500 pmol
   4. חישוב CPM / pmol ATP: [μL של ATP חם x (2.2 x 10 ⁷ ) x גורם דעיכה] / pmol של ATP קר.
      הערה: הערך של 2.2 x 10 ⁷ ממיר 0.01 mCi / μL של ATP ל- cpm.
   5. חישוב כמות של קינאז ב assay ב מ"ג. עבור קינאז רקומביננטי ו קינאזות immunoprecipitated, שיטות סטנדרטיות כגון מבחני BCA מתאימים כדי לקבוע ריכוז מתחיל. דוגמה: wtERK2 0.0002 מיקרוגרם / μL בתגובת 50 kinase μL הוא 0.01 מיקרוגרם, או 1 x 10 ^-5 מ"ג.
   6. חישוב סך מחיר לאלף הופעות ב- assay. להרכיב 30 תגובות μL ולהפעיל 20 μL מכל תגובה על ג'ל. הכפל את cpm נספר (לאחר חיסור ריק) על ידי גורם של נפח assay הכולל / נפח טעון. המשך האמור לעיללדוגמה, להכפיל את כל הספירות על ידי 1.5, או 30/20.
   7. חישוב הפעילות הספציפית של קינאז assayed:
      סה"כ CPM ב assay) / (cpm / pmol ATP) / (זמן assay בדקות) / (כמות של kinase ב מ"ג)
      הערה: חלוקת הערך הנ"ל ב -1,000 תשואות הפעילות הספציפית בננו-מולים / דקה / מ"ג
3. חישוב כמה מולס של פוספט משולבים לתוך המצע (כל עוד המשקל המולקולרי שלה ידוע). זה משמש כדי לקבוע את מספר phosphosites על חלבון מסוים לאחר התגובה יש הלך להשלמה.
   סך כל cpm assay) / (cpm / pmol ATP)] / (כמות של המצע ב pmols)

תוצאות

WNK1 IP מבחני kinase

Myc- מתויג WNK1 היה transfected לתוך תאים HEK293 ו immunoprecipitated עם נוגדן אנטי Myc ¹¹ . פעילות immunoprecipitate immunoprecipitate כלפי המודל המצע MBP כמו גם כלפי עצמו ( איור 1 א ). מוטציות WNK1 נבדקו א?...

Discussion

קינאזות הם משפחה מגוונת של חלבונים אשר התפתחו פונקציונליות נרחבת בהקשרים רבים, מבחני קינאז כבר שימושי מאוד בחקר חלבונים איתות כמה תרמו רבות להבנתנו הנוכחית של התקשורת הסלולרית. יש לציין, אותו assay הבסיסי שימש אפיון שני קינאזות שונות למרות הבדלים גדולים במבנה ופעילות....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Life Sciences	17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG035C010MC
Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610737
Radioactive shielding	Research Products International	BR-006
R-250 dye (Coomassie)	Thermo Fisher	20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper	Whatman	1003-917
Slab gel vacuum dryer	Bio-Rad	Model 583 Gel Dryer #1651745
Autorad marker	Agilent Technologies	420201
Phosphorescent ruler	Sigma Aldrich	R8133
Phosphorescent dots	Sigma Aldrich	L5149
Geiger counter	Ludlum	Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8x10"	Carestream Health	107 2263
BioMax MS Film 8x10"	Carestream Health	829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8x10"	Carestream Health	851 8706
Medical/X-ray film processor	Konica Minolta	SRX-101A
Scintillation vials	Research Products International	125500
Scintillation fluid	MP Biomedicals	188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter	Beckman	LS 6500